《遗传实验》word版

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1、实验五细菌质粒DNA的提取一实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法。二、实验内容本实验涉及细菌内质粒的提取方法。三、实验要求采用集中授课、学生自主训练并重的模式组织教学。四、实验准备学生需要与质粒相关的知识。五、实验原理、方法和手段质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录

2、要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活。质粒通常含有编码某些酶的基因，如抗生素抗性基因、大肠杆菌素基因、肠毒素基因某些限制性内切酶与修饰酶基因等，因而它的存在使宿主具有一些额外的特性。F质粒（又称F因子或性质粒）、R质粒(抗药性因子)和Col质粒（产大肠杆菌素因子）等都是常见的天然质粒。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringentcontrol）和松驰控制型（Relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能

3、复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制质粒拷贝数可由原来的20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制

4、及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占优势。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的

5、。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBS等。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多数质

6、粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些序列可用于产生序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同

7、大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起。而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条

8、链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA（OpencircularDNA,简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。六、实验条件（一）菌株含PUCm-T质粒的大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株。（二）实验仪器及用具1.5mLEppendorf离心管，微量取液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(