貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究作者：杨明妍刘洋，张丽华，李明成，王冰梅【摘要】目的探讨貂心脱氧核糖核酸(DNA)指纹特征鉴定方法。方法采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。结果从新鲜貂心及鸡心、鸭心、鹅心、兔心等伪品动物组织中提取出相同大小的线粒体DNA，只有貂心DNA可扩增出1100bp大小的片段。结论貂心DNA具有特异性指纹特征，所得貂心DNA指纹特征图谱可用于

2、与其伪品动物心脏的鉴定及分析，且方法简便，结果可靠。【关键词】貂心;线粒体DNA;指纹特征;鉴定貂心是名贵的药材,是利心丸[1]中的主要成分。貂心在药品检验中尚无完善的检验方法，现有的检验方法只有企业内控标准的性状鉴别，无法对貂心的真伪作出准确的判断。DNA指纹图谱技术为中药材及其伪品的鉴别提供了一条新的途径[2,3]，课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创

3、新性的成果本文应用分子生物学技术，对貂心及其伪品进行了DNA指纹特征研究，采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。建立了貂心DNA指纹鉴定方法，确立了貂心DNA指纹特征图谱，为貂心与其伪品的鉴定提供了一种分子生物学检测手段。　1材料与仪器药材新鲜貂心、鸡心、鸭心、鹅心、兔心均由农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测实验站提供。1.试剂BufferA：/L,/LTris-HCl,1mmol/LNa2EDTA，();BufferB：/L蔗糖，/LTris·HCl，mmol/LMgCl2,;BufferC：(/

4、LTrisoHCl，mol/LNaCl，mol/LNa2EDTA，;DnaseI反应终止液：/L蔗糖,mol/LNa2EDTA,;购自北京鼎国生物技术有限责任公司。TaqDNA聚合酶：大连宝生物工程公司;琼脂糖：购置England。1.仪器紫外透射仪(ZF型)：中国上海;电泳仪、电泳槽(DYY-Ⅲ2)：北京六一仪器厂;GeneAmpRPCRSystem2700AppliedBiosystem：美国Perkin-Elmer公司;UVWHITE2020D凝胶成像分析系统：美国Coldspring公司。　方法.1线粒体DNA的提取[4,5]①取新鲜的组织，用

5、BufferA洗净，剪碎，研磨，按1∶5的重量体积比稀释，000r·min-1℃离心30min，吸上清，除去核及细胞膜碎片。②上清液1000r·min-14℃离心30min,弃上清，沉淀为线粒体。③用BufferB洗涤1次，按·g-1组织的比例悬浮，加DnaseI使终浓度达100μg·ml-1，30℃保温4min,冰浴冷却，加入2倍体积的DnaseI反应终止液，1000r·min-1℃离心30课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和

6、理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果min,沉淀用DnaseI反应终止液洗涤一次，重复离心，得纯净的线粒体。线粒体用BufferC悬浮(·g-1)，加入10%SDS至终浓度%，37℃保温15min，冰浴冷却，加等体积的饱和酚轻微震荡至溶液呈乳白色，冰浴30min。1000r·min-1℃离心10min，取水相重复提取至界面无蛋白为止。④上层水相再用氯仿/异戊醇(24∶1)提取3次去酚，水相中加入倍的1mol/LNaAc,混匀，再加入2倍体积的预冷-20℃的无水乙醇，混匀置于低温冰箱中过夜。1000r·mi

7、n-1℃离心30min,真空干燥，溶解于TE缓冲液。⑤加入Rnase至终浓度为50μg·ml-1，37℃保温1h，然后用饱和酚、氯仿/异戊醇各抽提3次，水相中加入1mol/LNaAc及无水乙醇沉淀mtDNA，用70%乙醇洗涤3次，干燥，以TE溶解，即得纯品。-20℃保存。.紫外分光光度法的测定mtDNA将所获得的mtDNA样品经适当稀释，用紫外分光光度仪测定光吸收值A260、A280值，计算A260/A280比值。.琼脂糖凝胶电泳制备%琼脂糖凝胶(含EB/L)，取5μlmtDNA样品并加入1μl上样缓冲液混匀后点样,0V，90min，成像并拍照。.PC

8、R检测应用引物设计软件设计貂心的特异性引物(由上海生物工程公司合成)。PCR反应体系：总体积为