acmnpve18基因酵母双杂交诱饵载体构建与转录自激活检测

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1、AcMNPVel8基因酵母双杂交诱饵载体构建与转录自激活检测摘要：用PCR方法扩增苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultipienucleopolyhedrovirus,AcMNPV)被膜蛋白0DV-E18基因，克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-el8o将诱饵质粒分别转化酵母菌株Y187和AH109感受态细胞，被转化细胞在涂有X-gal的SD/-Trp营养缺陷型固体培养基上形成白色菌落；在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固体培养基上均不形成菌落，表明诱饵基因表达产物BD-E1

2、8在这两种细胞中都不能激活报告基因转录。pGBKT7-el8转化的Y187细胞在SD/-Trp营养缺陷型液体培养基中的生长速度与空载体转化细胞相同，显示BD-E18对酵母细胞无细胞毒性。结果表明，AcMNPV0DV-E18可能不直接参与对宿主细胞或病毒基因表达的调节，其编码基因可以作为诱饵基因通过筛查病毒宿主cDNA文库识别与其相互作用的蛋白质。关键词：苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)；0DV-E18；酵母双杂交；自激活；细胞毒性中图分类号:Q785文

3、献标识码：A文章编号:0439-8114(2013)10-2436-03苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是a-属杆状病毒的代表种，感染30多种鳞翅目昆虫，是目前研究得最多的杆状病毒种［1］。AcMNPV在其复制周期中产生两种结构和功能不同的病毒体：包含体源病毒体(0DV)和芽殖病毒体(BV)oODV和BV分别执行病毒在宿主种群个体间的传递和受感染虫体内的系统感染功能［2］。这两种病毒体包含序列相同的基因组，但蛋白质组成存在差异。目前已经鉴定出40多种A

4、cMNPVODV结构蛋白和相似数目的BV结构蛋白。其中33种结构蛋白共存于0DV和BV病毒体，0DV和BV各有10多种特有蛋白质［3,4］。AcMNPV0DV-E18最初被发现是一种0DV被膜蛋白［5］。最近的研究报道表明，该蛋白质也存在于BV被膜［4］。el8基因存在于所有已完成测序的杆状病毒基因组，是杆状病毒33个核心基因之一。缺el8基因的AcMNPV基因组在被转染的细胞内不能完成BV复制［6］。其作用机制尚未明了。为了解el8基因在杆状病毒复制过程中的作用，拟通过酵母双杂交筛选与ODV-E18相互作用的宿主细胞蛋白。研究克隆了AcMNPVel8基因开

5、放阅读框，构建了诱饵载体并完成了其在酵母细胞中的自激活和毒性检测。1材料与方法1.1材料AcMNPV.酵母AH109和Y187菌株、pGBKT7质粒(购自美国Clontech公司)由华中师范大学生命科学学院/遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室保存，SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade营养缺陷型培养基购自美国Clontech公司，DNA限制性内切酶购自Fermentas(MBI)公司，T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司，PfuDNA聚合酶购自北京普博欣生物科技有限责任公司。1.2方法1.2.1el8基因PCR扩增和诱

6、饵载体的构建根据AcMNPV基因组序列［7］设计el8基因开放阅读框(nt125153-125341)的上游引物el8UP:5'-GGCGAATTCATGTTCTTGACCATCTTG-3'和下游引物el8DN：5'-CTTGCTGCAGTGACCGTTCGAACTTTG-3',以AcMNPVDNA为模板进行PCR扩增。el8UP和el8DN分别对应AcMNPV基因组序列nt125153-125170和nt125376-125394o两者分别附加EcoRI和PstI限制性内切酶的识别序列。用EcoRI和PstI分别双酶切el8基因的PCR产物和pGBKT7载

7、体，将回收的酶切载体和PCR片段进行连接反应，构成诱饵载体pGBKT7-el8o1.2.2酵母菌株感受态细胞的制备及诱饵载体的转化在YPDA固体培养基平板上划线活化酿酒酵母Y187菌株和AH109菌株，于30°C恒温培养箱中倒置培养3〜4d；挑取生长状况良好的单菌落接种于3niL的YPDA液体培养基中，于30°C.250r/min振荡培养8h；从中取4uL的菌液接种到25mLYPDA液体培养基中，于30°C、250r/min继续振荡培养14〜20h,至0D600nm达到0.15-0.30；离心、弃上清，将细胞沉淀重新悬浮于50mLYPDA液体培养基中，于30

8、°C、250r/min继续振荡培养3〜6h,至0D6