丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究

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1、丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究张丹，翟永贞，冯国和*(中国医科大学附属盛京医院感染科，辽宁省沈阳市110021)【摘要】目的：构建含丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)核心(core,C)蛋口基因的酵母双杂交诱饵载体，为HCVC蛋口与宿主蛋白相互作用机制研究挺定基础。方法：PCR法从含冇HCVlb基因型C蛋片基因的重组质粒pCMH6K-Core屮扩增C基因，经EcoRI和PstI双切后插入到诱饵载体PGBKT7中，构建含HCVC蛋口基因的酵母双杂交诱饵载体并命名为pGBKT7-Core,经酶切分

2、析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋口卬迹法(Westernblot)检测HCVC蛋口的表达,并通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果：重组质粒pGBKT7-Core屮的C蛋白基因为576bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCVlb基因型C蛋口基因序列相一致;转化酵母菌后用Westernblot检测到C蛋白的表达；HCVC蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性，且对报告基因无激活作用。结论:含HCVC蛋口基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core构

3、建成功，表达稳定。【关键词】肝炎病毒，丙型；病毒核心蛋白质类；酵母双杂交技术ConstructionandidentificationofthebaitvectorcontainingthegeneencodingHCVcoreproteininyeasttwo-hybridsystemZhangDan,ZhaiYong-zhen,FengGuo-he(DepartmentofInfectiousDiseases,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110021,Liaon

4、ingProvince,China)[Abstract]Objective:ToconstructabaitvectorcontainingthegeneencodinghepatitisCvirus(HCV)core(C)proteininyeasttwo-hybridsystem,layingthefoundationforfurtherstudyofthemechanismofinteractionbetweenHCVCprotein作者简介:张丹，在读博士，讲师，主要从事丙型肝炎病毒感染与防治的研究oE-mail:zhangd@

5、sj-hospital.org通讯作者：冯国和，辽宁省沈阳市铁西区滑翔路39号中国医科大学附属盛京医院感染科。E-mail:fenggh@sj-hospital.org电话:024-96615-62101andhostproteins.Methods:ThecDNAfragmentencodingHCVCproteinwasamplifiedbyPCRfromtherecombinantplasmidpCMH6K-CorewhichcontainsthegeneencodingCproteinofHCVlbgenotype,thendi

6、gestedbyEcoRI/PstIandclonedintothebaitvectorpGBKT7toconstructrecombinantbaitplasmidpGBKT7・Corc・ThenrightfragmentofrecombinantplasmidpGBKT7-CoretestedbybothrestrictionendonucleaseanalysisandsequenceanalysiswastransformedintotheyeaststrainY2HGoldbyLiAcmethod.Theexpressiono

7、fHCVCproteinwasdetectedbyWesternblot.Thetoxicityandautoactivationofbaitproteinwastestedbyphenotypeassay.Results:ThegeneencodingHCVCproteinintherecombinantplasmidpGBKT7-Corewas576bpandconsistentwiththatofHCVlbgenotyperegisteredinNCBI.TheexpressionofCproteinwasdetectedbyWe

8、sternblotafterbeingtransformedintotheyeastcell.HCVCproteinwasnottoxictotheyeaststrainY2HGold,andcouldno