nr2b在小鼠骨癌痛中作用及机制的研究论文

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1、储躲塑学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。期：受!!年』月上日摘要目的建立新的小鼠骨癌痛模型，观察NMDA受体2B亚基(NR2B)在骨癌痛小鼠前脑扣带回和脊髓中的表达及分布情况；明确NR2B与癌痛产生之间的关系；探讨NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制。方法1．小鼠骨癌痛新模型的制备及评价：选用成年雄性C57BL／6小鼠30只，随机分为4组，模型

2、组(15只)：接种Lewis肺癌细胞2×106个；热灭活组(5只)：接种相同数目加热灭活的Lewis肺癌细胞；PBS组(5只)：接种等容积的PBS液；正常对照组(5只)：不予任何处理。接种后7天始隔日观察小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。第7、15、23天，将小鼠麻醉后行双侧后肢X线摄片，评估肿瘤诱发的骨组织破坏程度。模型组小鼠每次摄片后任选5只取术侧后肢，各对照组小鼠最后一次摄片后取术侧后肢，分别作苏木素．伊红(HE)染色观察骨质破坏情况。2．NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分布与表达：选用成年雄性C57BL／6小鼠81只，随机分为3组：癌

3、痛组，假手术组和正常对照组。观察三组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。分别于术后第6、10、14、18、22天各取3只，实时定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2BmRNA的表达。依据PCR结果，每组分别于术后第14、18天各取3只，免疫组化检测前扣带回和脊髓NR2B的分布和表达；同时每组另各取3只，于术后第14、18天行WesternBlot检测脊髓NR2B蛋白的表达。3．脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响：选用成年雄性C57BL／6小鼠72只，随机分为3组：癌痛组，干扰组和干扰对照组。观察各组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。每组分别于接种后

4、第13、14、15、16、18、22天各取3只，实时定量PCR检测脊髓NR2BmRNA的表达。依据PCR的结果，于接种后第14和18天每组各取3只，WesternBlot检测脊髓NR2B蛋白的表达。4．MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制：选用成年雄性C57BL／6小鼠48只，随机分为4组：正常组，癌痛组，干扰组和干扰对照组。观察各组小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。每组分别于接种后第14和18天各取3只，实时定量PCR检测脊髓NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表达水平。选取接种后第14和18天的每组小鼠各3只，Wester

5、nBlot检测脊髓NR2B、P．ERK、P．p38和GFAP蛋白表达水平。结果1．小鼠骨癌痛新模型的评价：模型组接种后第1l天左右出现明显自发痛行为，表现为白发抬足时间延长；接种后第13天左右出现明显的触诱发痛，表现为50％缩足阈值明显下降，且持续整个观察期。接种后第23天放射学结果显示，术侧股骨下段骨髓腔消失，骨皮质中断、大块缺损。同时组织学可见肿瘤细胞充满骨髓腔，且穿破骨皮质向外生长，侵犯周围肌肉组织。行为学、放射学、组织学三方面证实建模成功。2．NR2B在骨癌痛小鼠的前扣带回和脊髓中的分布与表达：(1)前扣带回NR2B的实时荧光定量PCR结果显

6、示：接种后第6天、10天，癌痛组NR2B的表达与假手术组比较无显著差异，而癌痛组和假手术组NR2B的表达比正常组明显增高：第14天、18天，癌痛组NR2B的表达明显增加，与假手术组和正常组比较，有显著差异(p0．05)I第22天，癌痛组NR2B的表达下降，与假手术组和正常组比较无统计学意义。IA．6段脊髓NR2B的实时荧光定量PCR示：接种后第6天，癌痛组NR2B的表达与假手术组比较无显著差异，而癌痛组和假手术组NR2B的表达比正常组明显增高；第lO、14、18、22天，癌痛组NR2B的表达明显增

7、加，与假手术组和正常组比较，有显著差异(pO．05)。(2)IA．6段脊髓和前扣带回NR2B免疫组化测定结果：癌痛组NR2B主要分布在脊髓背角浅层、中央导水管、前角以及小鼠的前扣带回，脊髓各层NR2B表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次增多。癌痛组于术后第14、18天，脊髓和手术对侧的前扣带回区NR2B阳性细胞光密度(OD)值与假手术组和正常组比较有统计学差异(P<0．05)；而假手术组与正常组比较，无显著差异(p>0．05)。(3)IA．6段脊髓NR2B表达的WesternBlot检测结果：癌

8、痛组于接种后第14天、18天，脊髓NR2B的表达明显增高，与假手术组和正常组比较，有显著差异(p