NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究(黄东)

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1、NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究中南大学湘雅三医院黄东教授※目前，全球癌症患者的数量呈＊骨癌痛的具体机制※癌性疼痛成为影响癌症病人生活质量的一个严重问题。※在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制。?研究背景癌痛的特点:临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴随有爆发痛；癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不同的外周和中枢机制[1]。如癌痛：胶质细胞增生肥大；GFAP[1]:HonoreP.Neuroscience,2000,98:585–598.★NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化的基础，是持续性疼痛产生和维持的关键[2]。★

2、大量研究证实：NMDA受体的亚基NR2B在炎性痛、神经病理痛中参与了伤害性信息传递，在疼痛调制及痛觉敏化的形成和维持中发挥重要作用[3]。疼痛研究进展[2]:Petrenko.AnesthAnalg.2003,97(4):1108-1116.[3]:NagyGG.EurJNeurosci,2004,20(12):3301-3312.（一）★研究显示，MAPK信号通路在神经可塑性和炎症反应的细胞信号转导过程中起重要作用[4]。★增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸性蛋白（GFAP），骨癌痛的产生和维持与脊髓星形胶质细胞结构和功能的

3、变化密切相关[1]。[4]:DeLeoJA.Pain,2006,122(122):17221.疼痛研究进展（二）研究癌痛的确切机制，需要适当的动物模型，现有动物模型仍显不足。小鼠骨癌痛模型的优势■肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤，且小鼠在肿瘤学及神经系统研究方面具有独特的优势。■小鼠作为实验模型，较经济适用■本实验参照Schwei等的方法，将Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一个全新的骨癌痛模型。我们从如下四个方面加以研究：1、建立一个小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分布与表达3、脊髓

4、NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响4、MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制NR2B是否也参与骨癌痛的发生机制呢？实施方案：◆检测癌痛小鼠脊髓和前扣带回NR2B的表达和分布，分析小鼠NR2B的表达和小鼠疼痛行为学关系。◆应用RNA干扰技术，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠NR2B的表达以及两组小鼠疼痛行为学，从而阐明NR2B是否在癌痛的发生与维持中起重要作用。◆对比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK信号通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变；◆研究MAPK信号通路中信号分子表达的相应改

5、变与GFAP的关联性；▲探索MAPK信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机制。NR2B是怎样参与骨癌痛的发生机制呢？选用清洁级雄性C57BL/6小鼠模型组一般情况观察行为学测定内容1技术路线热灭活组PBS组正常对照组放射学检查组织学检测自发痛行为观察机械性触诱发痛选用清洁级雄性C57BL/6小鼠癌痛组一般情况观察行为学测定内容2技术路线假手术组正常对照组实时定量PCR检测NR2B的表达免疫组化检测NR2B的表达及分布自发痛行为观察机械性触诱发痛WesternBlot检测NR2B的表达选用清洁级雄性C57BL/6小鼠癌痛组一般情况观察行为学

6、测定内容3技术路线干扰组干扰对照组实时定量PCR检测NR2B的表达自发痛行为观察机械性触诱发痛WesternBlot检测NR2B的表达选用清洁级雄性C57BL/6小鼠正常组一般情况观察行为学测定内容4技术路线干扰组干扰对照组实时定量PCR检测NR2B、SP、c-fos和GFAP基因的表达自发痛行为观察机械性触诱发痛WesternBlot检测NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP的表达癌痛组结果体重和一般状况图1：观察期内各组小鼠体重的变化2.行为学测试图2：自发痛行为观察图3：机械性触诱发痛测定3.放射学检测图4：模型组小鼠不同时

7、间段术侧股骨X片结果:A为肿瘤细胞接种前摄片；B为接种后第7天；C为接种后第15天；D为接种后第23天。组织学观察骨髓腔内可见较多肿瘤细胞骨髓腔内大量肿瘤细胞浸润且骨小梁破坏肿瘤细胞侵犯周围肌肉骨髓腔破坏，肿瘤细胞穿破骨组织A:接种第7天模型组小鼠股骨切片B:接种第15天模型组小鼠股骨切片C:1接种第23天模型组小鼠股骨切片C2:接种第23天模型组小鼠股骨周围肌肉组织病检结果图6：模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的HE染色（HE×400）▽行为学、放射学、组织学三方面证实：C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞，能成功制备

8、小鼠骨癌痛模型，且此模型稳定、重复性好，与人类骨癌痛高度相似。▽本研究我们首次选用来源广泛、致瘤作用强的Lewis肺癌细胞，接种于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立了一个新的小鼠骨癌痛模型。5、实时荧光定量PCR检测前扣