血清抗htert自身抗体作为癌症诊断标志物的初步的的研究

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1、贵阳医学院2012届硕士研究生论文血清抗hTERT自身抗体作为癌症诊断标志物的初步研究专业：临床检验诊断学研究生：周爱群导师：刘杰麟教授摘要：目的：通过构建人端粒酶逆转录酶中段（hTERT-m）、C-端（hTERT-c）蛋白原核表达系统，并分离提纯获得高纯度的hTERT-m和hTERT-c蛋白，以此两种蛋白为抗原利用间接ELISA技术检测癌症患者血清抗hTERT自身抗体水平，为血清抗hTERT自身抗体能否作为一项新的肿瘤标志物提供实验依据。方法：1.质粒载体pMAL-c5X和重组质粒pMAL-p5X-hTERT-m、pMAL-p5X-hTERT-c

2、经限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收获得带有相同粘性末端的质粒载体和目的基因，T4DNA连接酶16℃连接过夜；2.连接产物转化克隆菌株NEB10-β大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒进行酶切及测序验证；3.重组质粒pMAL-c5X-hTERT-m、pMAL-c5X-hTERT-c转化表达菌株TB1大肠杆菌感受态细胞，挑取单个菌落进行小培养，0.3mmol/LIPTG诱导目的蛋白表达，经12%SDS-PAGE初步验证目的蛋白是否表达；4.重组表达菌TB1扩大培养，0.3mmol/LIPTG诱导目的蛋白表达，运用直链淀

3、粉树脂层析柱和BioLogicDuoFlow蛋白纯化仪分离提纯目的蛋白，经SDS-PAGE、Westernblot鉴定、考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质浓度。5.利用间接ELISA法检测135例癌症患者、96例良性疾病患者及135例正常对照组血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗体的水平，检测结果进行统计分析。结果：①成功构建pMAL-c5X-hTERT-m-TB1、pMAL-c5X-hTERT-c-TB1原核表达系统，并能大量表达可溶性目的蛋白；②成功获得高纯度重组hTERT-m和hTERT-c蛋白，浓度分别为0.266mg/mL和1.0mg

4、/mL；③间接ELISA法检测血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗体结果发现：正常对照组、良性疾病组和癌症组血清抗hTERT-m自身抗体测定OD值（X±s）分别为0.302±0.063、0.421±0.093和0.525±0.166，抗hTERT-c自身抗体测定OD值（X±s）分别为0.400±0.075、0.527±0.107和0.650±0.187；癌症组高于良性疾病组和健康对照组（P<0.001），良性疾病组高于正常对照组(P<0.001)；肺癌、大肠癌、乳腺癌和卵巢癌患者血清抗hTERT自身抗体水平高于相应良性疾病患者血清，差异有1

5、贵阳医学院2012届硕士研究生论文统计学意义。结论：癌症组患者血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗体水平显著高于良性疾病组患者和正常对照组，提示血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗体有可能成为一项新的肿瘤标志物。关键词：人端粒酶逆转录酶；原核表达系统；间接ELISA；癌症；亲和层析2贵阳医学院2012届硕士研究生论文前言肿瘤(tumor，neoplasm)是一类常见病、多发病，其中癌症是目前危害人类[1]健康最严重的一类疾病。据最新癌症统计数据显示，2008年全球新发癌症病例数1270万，死亡病例数760万，相比2002年的统计数据

6、均显著上升；而其中56%的新发病例和64%的死亡病例发生在发展中国家。随着手术、化疗、放疗等治疗方法的进步，许多癌症患者的长期存活率有所提高，但部分患者仍不能免于复发或转移，尤其是大部分癌症患者在发现时已属晚期，更为其治疗增加了困难。端粒及端粒酶的发现为肿瘤的研究翻开了新篇章。研究发现，端粒酶的激活与肿瘤的形成密切相关。人类端粒酶（humantelomerase），是一种包含多个亚基的特殊逆转录酶，能够维持真核生物染色体末端即端粒（telomere）的稳定性及长度。端粒酶的催化中心主要由其蛋白组分端粒酶逆转录酶(humantelomeraserev

7、ersetranscriptase，hTERT)和RNA组分端粒酶RNA(humantelomeraseRNA，hTR)组成。其中，hTERT为端粒酶催化作用的限速因子，hTR为端粒酶催化反应的模板。在人类大部分正常体细胞中，端粒酶的表达受到严格限制，因此随着细胞的不断分裂，端粒缩短，最终促发细胞复制衰老或细胞[2,3]凋亡，而在永生化细胞和癌症细胞中，端粒酶活性被激活而重新表达。有研究者将hTERT基因导入端粒酶阴性的正常细胞，结果均高效诱导出端粒酶活性[4,5]并使细胞逃避复制衰老而永生化，这些研究均提示hTERT为端粒酶的限速因子，因此越来越

8、多的研究者们开始把目光放在hTERT上。在癌症患者体内可检测到针对细胞内组分而产生的自身抗体在很久以前已[6]被证实：在肺