里氏木霉rutc30甘露聚糖酶基因man1在毕赤酵母中的高效表达

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1、摘要甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分，分布广泛。D一甘露聚糖酶能水解底物生成甘露寡糖，释放出与之结合的水分、微量元素等。应用于猪、鸡、鸭和水产动物日粮，可提高饲料的利用效率，减少养殖业环境污染。甘露寡糖具有改善动物胃肠道微生态环境的功能。多种细菌、真菌、软体动物等分泌B一甘露聚糖酶，其基因属于糖基水解酶家族5。B甘露聚糖酶在工农业生产和环境保护等方面有着厂泛的用途。因此本研究的主要目的就是构建甘露聚糖酶的。J一程酵母来高效表达甘露聚糖酶，以解决目前甘露聚糖酶产量低、成本高等问题，同时也为生产甘露寡糖

2、提供有效的解决途径。本文利用毕赤酵母(JDfc^蛔p口sfor捃)表达甘露聚糖酶(mannanaSe)。首先将mnnl克隆到毕赤酵母穿梭表达载体pPIc9K中，构建重组质粒pPIc9KwⅫl，经黝cI线性化酶切PEO将其整合到毕赤酵母Gsll5(HisMut+)染色体上，利_E；

3、jMM、MD平板筛选His+Mul8型阳性克隆，在含不同浓度G4I8一YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选28株附性克隆，将筛选到1株高拷贝菌株进行5L发酵罐优化表达研究，经测定蛋白分泌量达15m∥mI，。表达产物经sDs—PAGE电泳

4、分析，重组目标蛋白质量分数达到总蚩白的90％以上：相对分子质量为66KD，较理论设计值大，分析是因目标蛋白发生糖基化所致。该重组转化子RMAN23遗传稳定性良好。甘露聚糖酶活性测定结果为250Iu加L(刺槐豆胶为底物)和470Iu／n1L(魔学为底物)。通过酶学性质研究该酶反应晟适口H45，最适温度60℃。根据sDs—PAGE电泳和酶的功能分析，证明目的蛋白已在尸fcA抽p∞fDr括中成功实现表达，并且酶的表达量高丁国内外文献的相关报道。关键词：里氏小霉：甘露聚糖酶：毕赤酵母AbstractBela。Inann

5、anase(endo一1，4一Bmmannanase；EC3．2．1，78)catalyzesendo—wisehydrolysisofthebackboneofmannanandhele∞辑ann8藏s，whic珏棚≈掘eseco聪mostab臻d黼lbemicell珏losepolysaccharidesinnature．Dietarysupplementationofmannanaseinpi舀broileLduckandnsh{mp糖V。s嬲l辩翻per受rm铺ce躐d孰d∞nVefsi。ne鞭elen

6、cM艄dfeducean{malmanurepOiiut{onprobIemThep—mannanaSeencodinggenesbeIongstofamiIies5ofglycosidehydrolaseen科mes，andhaVealreadybeenclonedn。mmammabmngi，andbacteria．ThemannanaseproductisanInterestingcalldidateforindustrialandagficultural印p{icationslomal(em{nerals

7、，amjfl0acids，andpo】ysaccharidesaVa柏ableforanimalnutrition，andforenvironmen诅lDrotection11heo毯eetoflhep咒sentstudy’stoeons静娃etthereeombin袅嗽yeastfor搬￡hi曲一{evelexp辩ssienofthemannanase，inordertoproVideane币cientwa)，tosolvetheproblernssuchaslow争foduc{iona喇鞋痨∞筑a艏鑫lso

8、wee强g髓hi盛一司髓嚣每M巍nan—ol埝osaccharides汝啦ee粕．Inthestudy'the删髓H1wasclonedandinsert。dintotheplasmidpPIC9Ktoconstructrecombin鞠tplasmidpPlc9K一掰溯1『oilowedbylinoafiz-ngbyrestri川onendonuciease瓤ciThen．twastransformedintothehostp国南蛔p甜幻，趣GSll5byPE&0nMMandMDpla把s，28His+Muf

9、positjvecolonieshadbeenscreened4colonieswithhigh—copypurpos。geneweregainedbytheG4l8瞧en。t}c{n)reslst矗ncesc犯eni“g+Anl。}毽氇。m，oneeolonyw撞scultur。dlna5L1iterfermentorforIheexpressionofrecombjnanlmann