基因剂量及培养温度对β甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

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1、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文

2、收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：燃导师签名区娃遗日期：丛年』月』硕士学位论文摘要lIIIHHMIIIIIIIIIIIIlUlY2424856p．1，4．D．甘露聚糖酶(endo．1，4．d．mannanase，EC3．2．1．78)能够随机催化水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的p．1，4．甘露糖苷键。它有着许多潜在的应用，例如纸浆漂白，降低咖啡提取物的粘度，提高饲料的营养价值和用于石油开采等。D．甘露聚糖酶已经广泛的在毕赤酵母中异源表达，为了提高p。甘露聚糖酶在毕赤酵母中的产量，本文研究了基因拷贝数及培养温度对B．甘露聚糖

3、酶在毕赤酵母中表达的影响，以期望通过构建适当的p．甘露聚糖酶基因拷贝数毕赤酵母工程菌，并合理控制发酵条件来提高外源蛋白的表二士且尬里。采用双标准曲线法，分别利用已构建好的含有GAP和MAN基因的标准质粒进行实时定量PCR反应，建立双标准曲线，利用实时荧光定量PCR检测毕赤酵母中外源p．甘露聚糖酶基因的拷贝数。通过qPCR筛选出了分别含有1、3、4、5、7个拷贝数的5株菌来用于研究基因剂量对外源基因p．甘露聚糖酶在毕赤酵母中转录和表达水平上的影响，并比较了不同拷贝数菌株的生理特性，实验结果表明mRNA量随着拷贝数的增加而增加，但是酶活和蛋白水平则是起初先随着拷贝数的增加而增加，然后当拷贝数大于

4、4之后，不再随着拷贝数的增加而增加；而且重组菌株的基因拷贝数越多，其底物利用能力越差，生长越慢，最终达到的菌浓度越低；所有不同拷贝的重组菌株其外源基因在发酵培养100h内都是稳定遗传，且13-mannanasemRNA在整个培养过程中恒定表达。通过比较不同温度下B．甘露聚糖酶在转录和蛋白表达水平的差异，发现降低温度虽然降低了mRNA表达量，但是外源蛋白得到积累增加，而且发现温度对高拷贝数菌株影响更显著；降低培养温度可以显著提高重组菌株的活性，从而减少细胞死亡带来的胞内蛋白酶的释放，最终使得低温下发酵液中的蛋白酶活力显著下降。关键词p．甘露聚糖酶，qPCR，基因剂量，毕赤酵母，mRNA表达硕士

5、学位论文ABSTRACTABSTRACTlB-mannanase(endo一1，4-D—mannanase，EC3．2．1．78)catalyzestherandomhydrolysisofp-1，4一mannosidiclinkagesinmannan，galactomannan，glucomannan，andgalactoglucomannan．Ithasmanypotentialapplications，forinstance，pulpbleaching，coffeeextractDsityreducing，feednutritiona。vak‘provingandoi—drilLgV

6、ISCOSItyreducingteednutritionalvaluelmorovlngandoildriling．，．Sof砒13-mannanaseshavebeenextensivelyexpressedheterologouslyinPichiapastoris．TheeffectsofgenedosageandculturetemperatureontheexpressionofPichiapastoriswereinvestigatedforimprovingtheproductionof[3-mannanaselnP{chiapastor&．Andthenthroughrea

7、sonablyconstructingPichiapastoriswithopportunegenedosageof13-mannanaseandcontrollingfermentationconditionstoimprovetheexpressionoftheexogenousprotein．Inthispaper,weutilizedthedoublestandardcurvemethodwhichw