小鼠dnd1慢病毒载体的构建与病毒生产

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1、摘要目的：在本研究中，将用PCR法从小鼠10．5d胚胎cDNA文库中扩增出的Dndl基因引入慢病毒载体系统，并生产Dndl慢病毒颗粒。为进一步明确Dndl体外生物学功能奠定基础。方法：1．Dndl基因的获得根据GenBank中小鼠Dndl基因序YIJ(BC034897)，使用DNAstar软件设计基因的特异引物Dndl—AgeI-F和Dndl—AgeI—R，并且引入AgeI酶切位点。用PCR法从小鼠10．5d胚胎cDNA文库中扩增出Dndl基因。PCR法筛选阳性克隆。2．重组慢病毒载体转移质粒pGC—FU—D

2、ndl的构建采用In—Fusion技术，将AgeI酶切回收后的PCR产物交换连接入AgeI酶切的pGC—FU真核表达载体，产生pGC—FU—Dndl质粒。连接产物质粒转化大肠杆菌E．coliDH5a感受态细胞，扩增质粒。3连接产物pGC—FU—Dndl的酶切鉴定收集部分扩增后连接产物质粒，酶切后经电泳证实所得片段长度均与预期相符，说明Dndl基因己克隆成功。基因测序结果亦证实成功克隆Dndl基因。4连接产物pGC—FU—Dndl质粒转染293T细胞用脂质体Lipofectamine2000包裹构建的pGC—只

3、『-一dndl和辅助包装载体，共转染293T细胞，产生含有表达Dndl蛋白的Lentivims病毒颗粒。结果：1成功获得Dndl目的基因片段。通过PCR筛选得到Dndl目的基因片段。2连接产物pGC—FU—Dndl的测序结果与GenBank中dndl基因序列(BC034897)比较，表明Dndl基因序列及读码框均正确。3三质粒转染293T细胞后荧光显微镜观察结果及Western—blot检测鉴定表明成功建立Dndl慢病毒表达载体系统。结论：1成功克隆小鼠Dndl基因和成功构建pGC—FU—Dndl质粒2pGC

4、—FU—Dndl表达载体经过转染293T细胞，48小时后观察到绿色荧光蛋白的表达：经Westernbloting检测到Dndl蛋白在293T细胞中的表达，从而证明我们成功建立了Dndl重组慢病毒，对其进行纯化后采用逐孔稀释法测定滴度，滴度测定结果为2E+9TU／ml。这为更深入的探讨Dndl基因抑制细胞增殖中等体外细胞生物学功能提供实验基础。关键词：慢病毒，载体，DNDl，基因ⅡABSTRACTObjectiveInthisstudy,wewillmakeanattempttoputDndlgenecomin

5、gfrom10．5d’SembryocDNAofmouseintolentiviralvectorsystem，whichwillestablishastrongfoundationforworkingoutthebiologicalfunctionoftheproteinexpressedbyDnd1．MethodsTheDNAfragmentofDndlcodingsequencewasamplifiedfrom10．5d’SembryocDNAbyPCRwithdesignedprimer,andthe

6、nsubclonedintopGC—FUvectorwithIn—Fusiontechniquetogeneratethelentiviralexpressionvector,pGC—FU—Dnd1．ThepositivecloneswerescreenedbyPCRandthecorrectDndlwasconfirmedbysequencing．Recombinantlentiviruseswereproducedin293TcellsfollowingthecotransfectionofpGC—FU—

7、Dndl，andpackagingplasmidsofpHelper1．0andpHelper2．0．Dndlproteinexpressionin293TcellswasdetectedbyWesternblot．ResultsandConclusionThecDNAfragmentofDndlgenewassuccessfullyamplifiedfrommouseembryocDNAlibrarybyPCR．ThelentiviralexpressionVectorCarryingDndlwassucc

8、essfullyconstructedandhightiteroflentiviruswassuccessfullyproduced，anditcanestablishafoundationforourstudythemolecularfunctionofDndl．KeyWords：Lentivirus，vector,DND1，geneⅡI英文缩略词表缩写全称中文翻译ADactivationdoma