四川猪流行性腹泻病毒流行株s基因分子特征与s蛋白抗原性初步的分析

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1、万方数据本研究受下列基金项目资助特此表示感谢国家自然科学基金项目(项目编号：No．31072144)NationalNaturalScienceFoundationofChina(NNSFOC，PROJECT：No．31072144)万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

2、研究生签轹叩关于论文使用授权的声明幽竹年7㈣7日本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。i柞论文不保密。口本论文保密，在年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：弘p丽导师签名：二豸：小必修年锄舻年c}其咿乞其一日万方数据摘要猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpi

3、demicDiarrheaVirus，PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染疾病。自2010年以来，PEDV感染已成为全球养猪业共同关注的问题。及时掌握PEDV流行毒株的分子特征，对指导该病具有重要意义。S基因编码的S蛋白是PEDV的重要结构蛋白，在诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护等方面起关键作用，S基因较易发生变异。本研究对四川2014年PEDV流行毒株的S基因(包括S基因全序列和部分序列)进行克隆、测序和分子特性分析，初步分析了流行株的S基因抗原性(包含COE区的抗原区域)。研究内容如下：(1)四川PEDV流行株S基因的克隆与分子特征分析：以RT-PCR检测了四川14个地

4、区的17个猪场的102份发病仔猪腹泻样本，猪场PEDV阳性率达到100％(17／17)，样品PEDV阳性率为88．2％(99／102)。PEDV多为单独感染。根据PEDV-CV777株序列(GenBank登录号：AF353511)设计3对引物扩增完整的S基因，选取2014年四川地区PEDV代表样品扩增了9株S基因全序列和18株S1区(起止位点：1．1389nt)，采用RT-PCR扩增S基因、克隆、测序和序列分析。结果表明：S基因S1片段变异较大，18株流行株S1片段全长为1398bp，编码466个氨基酸，存在大量核苷酸的突变、插入及缺失，多以C◆T、T◆C、G一◆T、T◆G等突

5、变形式存在。9株完整S基因中，8株全长为4161bp，编码1386个氨基酸，1株为4125bp，编码1374个氨基酸。PEDV四川流行株之间核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高，与SC．L株及CV777疫苗株等的同源性均较低，与2013．2014年US株、Thailand、2014年韩国株等的同源性较高。S基因编码的多肽链具有较好的亲水性，分别含有1个跨膜区域及信号肽切割位点，潜在的磷酸化位点及糖基化位点与CV777差异较大。密码子偏嗜性分析表明S基因对编码的Tfrp，Met，His，Asp，Cys氨基酸具有一定的偏嗜性。S蛋白含有多个0【螺旋区段、p折叠区段、p转角区域及

6、无规则卷曲区域。遗传进化分析结果表明，本研究中的PEDV四川地区流行毒株均属于同一群，18株四川流行株S1区与中国株CH8、YS、CHGD．01、GDMZ／2013、韩万方数据国株CNU．091222．01、美国株US～Iowa／18984／2013、USAIA2、USA／Indiana／17846／2013、USA／Kansasl25／2014、USA／Texasl28／2014、最新韩国株KoreaKUIDL．PED一2014．002及KUIDL．PED．2014．007、泰国株ThailandPPED0108、Thailand1．55ST0412、Thailand6．56

7、ST0413、ThailandSBPED0211．2等亲缘关系较近。COE区与S全基因与参考株的亲缘关系与S1区相似，但COE区具有地区性差异，这提示四川境内流行的毒株也在不断进化。此外，研究中所有四川地区PEDV流行毒株均与经典毒株CV777、Brl／87，中国早期流行毒株LZC、SC．L、DX、韩国株Chinju99、DRl3及日本株83p．5等亲缘关系较远。(2)S蛋白抗原性的初步分析：本研究设计了包含COE区的部分S蛋白片段(命名为SD蛋白)的特异性引物SD．F、SD．R，用RT-P