猪伪狂犬病毒（prv）糖蛋白gd基因植物转化和表达的研究

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1、摘要本文以模式植物烟草为对象，研究了猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesVims，PRV)糖蛋白gD基因在转基因植物中的表达。并在此基础上，以PRV糖蛋白gD基因和玉米胚乳特异表达启动子(GiobIlIin．I)构建的重组质粒pGLB-gD为载体，应用农杆菌介导法转化超甜玉米幼胚，成功获得了转基因植株；同时研究了根癌农杆菌浓度、共培养时间与温度对玉米转化率的影响。主要研究结果如下：1．利用叶圆片法，通过根癌农杆菌介导将PRV糖蛋白gD基因导入烟草叶肉细胞，经愈伤组织诱导、筛选、继代及再生，成功获得了再生植株。通过PCR分子标记、PcR．So

2、U【也em分子杂交确认gD基因已整合进烟草再生植株细胞的基因组中，经wbst啪一blotting杂交证明外源的PRv糖蛋白gD基因能在转基因烟草中正确表达。2．在26～28℃条件下，分别以0．3、O．6、1．O的菌液浓度(OD6∞值)浸染玉米幼胚5Inin，然后在22℃下进行共培养、恢复性培养和抗性愈伤组织筛选等过程，发现原菌液浓度在0D600值为O．5，感染浓度在O．3时，转化效率最高，抗性愈伤组织的形成率为23．7％。3．在原菌液浓度和感染浓度分别为OD600值0．5和013时。以22℃、25℃和28℃3个温度分别进行1d、2d和3d时间的

3、共培养，分别统计幼胚抗性愈伤组织的形成率，结果显示，在22℃共培养3d的条件下转化效率最高，抗性愈伤组织的幼胚的形成率为24．6％。4．由根癌农杆菌转化玉米幼胚获得的转基因玉米植株，经分子鉴定、点杂交、Southem印迹杂交，确认PRV糖蛋白gD基因成功整合进玉米植株细胞的基因组中。关键词：烟草；超甜玉米；农杆菌；PCR检测：PcR_soutll锄杂交；wbstem杂交：点杂交；Soulllem印迹杂交AbstractTakjngtobaccoasmetypeplant，thepresentthesisstudies血eexpressionof

4、pseudorabiesvirus(PRV)glyc叩roteingDgeneintraIlsgeilicplantsandsetsupasetofmethodsforplallttr孤sfonnin岛transgenicplamscreemn＆】eafprote砸extractingandotherS；allthesemethodsh“elaidthegroundworkfortransgenicmaize．0nsuchabasiswetransformhyper-sweetmaizeimmatureembryowiththepGLB—gDp

5、laSmidwhichwas叭1tbypGLBpla锄id，Globul¨promoterandPRV出ycoproteingDgenethoughmemediationofAgrobacteriumtumefaciens卸dsuccess删lyobtainthemmsgenjcp】a工lts，Thein丑uenceofAgrobact“umnunefaciensdenSity，t11e1eng血ofco—cul“Vationpefioda11dtempemtureonmmsfonnationratehasbeenstudiediIltheex

6、perimem．Thefindingsoftheexperimemalstudyareasfollows：1．Bymeansof1eaf-disc廿卸sfomationme也od，tobaccoistransformedbyAgrobacteriumt啪ef-aciens，success如Ilyinducingca工ius；thecailusthrou曲secondarycuItivation静owsintoanindependentplanLPCRd或ection，PCR—sollthernhy城dizationandWestem坶蹦diza

7、lionallprove恤tPIⅣ西ycoproteingDgenehasbeenintegratedintothetobaccogenomeandexpressedin也eri曲tway；thjsshowsthatPRVglycoproteingDgenecanberightlyexpressediIlplaIlts．2．Whenthetemperattlrestaysbetween26℃to28℃a11dtheOD600valueofthebact丽umsolutionarerespectjVelyO，3，O．6a11d1．O，themai

8、zeimmatureembryoafter5minutesinfectionuIldergoesco—cultiVation，restorativec