草原龙胆耐盐相关基因群的表达分析

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1、摘要草原龙胆(Eustomagrandiflorum)属龙胆科草本植物，是优良的鲜切花材料，它具有一定的耐盐性，在pH9盐碱地中，植株仍然可以完成生活史。本试验的目的是通过抑制消减杂交技术结合cDNA芯片技术分离草原龙胆赫胁迫诱导基因及耐赫相关基因群。抑制消减文库采用盐处理lh、3h、6h条件下草原龙胆等量混合的mRNA做为tester，未处理条件下草原龙胆的mRNA做为driver。将抑制消减杂交第2次PCR的产物连接至p(3EM．T载体中，随后转化到JMl09感受态细胞，经蓝白斑筛选、培养后提取质粒DNA。应用测序试剂盒(Amersham)进行质粒DNA测序PCR

2、反应，产物经纯化后在MegaBACE500测序仪上测序。得出的序列经SeqClust2．1软件去除冗余。结果共得到“53条200bp以上的序列，平均长度为375bp，去除载体和冗余序列，得到658条非重复序列。文库的冗余度为42．9％。将得到的658条序列进行GO分类，在生物学途径中分为有丝分裂检查点、类泛素化蛋白修饰、氧化胁迫反应、转运、电子传递等14类：分子功能中分为过氧化氢酶活性、催化活性、环氧化物酶活性、单氧化酶活性、谷胱甘肽脱氢酶活性等2l类；在细胞组件中分为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞核等10类。以‘‘primerl”和“primer2

3、R'’为引物，通过PCR的方法将以上获得的658个非重复基因片段从文库的质粒克隆中扩增出来用于芯片的制作。分别用Cy3、Cy5荧光染料标记盐处理和未处理草原龙胆的mRNA，按照3DNAArray9000试剂盒(GenisphereInc．)的使用说明完成芯片杂交。用ScanArray40000芯片扫描仪扫描芯片。通过limma软件包分析，结果显示，显著上调表达的基因为14条，显著下调的基因为16条。其中功能已知的序列为5条，分别为硫氧还蛋白、类泛素化蛋白、缩氨酸转运蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、细胞色素P450。关键词草原龙胆耐盐基因抑制消减文库eDNA微阵列limmaA

4、bstractEustomagrandiflorumisal【indofGentianaceaeherb∽cousplant．Itisverypopularasafleshcutflowerandhassalttolerance．Eustomagrandiflorum锄grownormallyinthesaline-alkalinegrasslands(soilpHat9．∞．ThepurposeofthisstudywastogetsaltinducedgenesandgenesrelatedtosalttolerancefromEustomagrandifloru

5、musingthetechniqueofsuppressionsubtractivehybridization(SSH)andthetechniqueofcDNAmicroarray．ThelibraryusedEustomagrandiflorum’SmRNAtreatedwithNaClforl。3and6h．whereequallyeommixmat鲥alswereregardedastester,andthemRNAofnon-stressmaterialsasdriver．ThesecondaryPCRamplificationproductsofSSHli

6、brarywereinsertedinpGEM-Tvector,andthentransferredintocompetentJMl09cells．Afterscreeningbyblue／whitespottestandsubsequentcellculture，theplasmidDNAWasextracted．SequencingPCRreactionoftheplasmidDNAWasperformedusingDyllamicETDyeTerminatorCycleSequencingKit(Amersham)．PurifiedPCRproductseque

7、ncesWgl"ereadbyMegaBACE500DNAAnalysisSystems．ThesegeneswereclusteredbySeqClust2．1software．Asaresult,1153highqualitysequenceslongerthan200bpwe糟isolatedwiththeaveragelengthof375bp，removingthevectorandredundancysequencingandWegot658non-repeatseq∞nces．Thelibraryredundancywas42．9％．T