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猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立摘要流产嗜性衣原体(Chlamydophilaabortus，CAB)是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体，孕妇也可感染而发生流产。集约化猪场的CAB感染必须引起重视。建立准确、快速的诊断方法是预防和控制本病的重要措施。本研究根据Genbank上公布的多型性外膜蛋白90(pomp90)基因序列设计引物，应用PCR技术获得CAB四种不同片断大小多型性外膜蛋白90(POMP90)的编码基因，构建重组表达质粒，在E．coliBL21中大量诱导表达，通过纯化及复性后得到纯度高、免疫学活性好的POMP90重组蛋白，并以它们为包被抗原，建立了猪CAB间接ELISA抗体检测方法，探讨了其在猪CAB感染血清学检测中的应用价值。1．根据己知基因序列设计引物，以流产嗜性衣原体CP／12株的总DNA为模板，PCR扩增了四种不同片断大小的pomp90基因，将目的基因与原核表达载体pGEX．KG进行连接，构建重组表达质粒，经测序证实构建成功。2．将构建成功的重组质粒在E．coliBL21高效表达，融合蛋白POMP．GST经纯化、复性后进行Western-blot检测，结果表明四种重组蛋白均具有较强的反应原性。3．分别以纯化后的四种重组蛋白作为包被抗原，经各项条件的优化，建立了间接ELISA抗体检测方法，并对大量的临床血清样品进行了检测。结果表明，该间接ELISA抗体检测方法具有灵敏度高、特异性好、准确等优点，且克服了传统间接血凝试验低灵敏度、判断主观性强等缺点。本研究构建了pomp90基因的原核表达质粒，进行原核表达，以纯化复性后的重组蛋白为包被抗原，建立了猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法，为进一步开展猪流产嗜性衣原体病的诊断研究奠定了基础。关键词：猪流产嗜性衣原体；多型性外膜蛋白90(POMP90)；诊断：ELISA；抗体 华中农业大学2009届硕士学位论文AbstractChlamydophilaabortus(CAB)wasoneoftheimportantpathogenscausingabortionofsow,COWandeweandpregnantwomen．CABinfectioninintensivepigfarmsmustbepaidenoughattention．DevelopmentofrapidandaccuratediagnosticmethodsistheessentialmeasureforthepreventionandCOntrolofthisdisease．Inthisstudy,theprimersweredesignedacCOrdingtothepolymorphicoutermembraneprotein一90(pomp90)genesequenceofCABpublishedinGenbankandfourdifferentfragmentsofpomp90genewereobtainedbyPCR．TherecombinantplasmidswereCOnstructedandexpressedinE．coliBL21，andthereCOmbinantPOMP90proteinswerepurifiedandrenaturated．ApplicabilitiesofthehighpurityandimmunologicreCOmbinantproteinswereexploredandtheindirectELISAmethodsfordetectingtheCABantibodyinSCTaofpigsweredeveloped．1．Fourdifferentfragmentsofpomp90genewereamplifiedwiththespecificprimersandthetotalDNAtemplateofCABstrainCP／12．TheobtainedgeneswereidentifiedbysequencingafterlinkedtotheprokaryoticexpressionvectorpGEX-KQ2．TherecombinantplasmidswereexpressedintheE．coliBL21，ThefourpurifiedfusionPOMP—GSTproteinshowed900dimmunereactivitydetectedbyWestern-blot3．111eindirectELISAmethodsforthedetectionoftheCABantibodywereestablishedusingthefourpurifiedreCOmbinantproteinsasCOatingantigensaftertheCOnditionswereoptimized．Thenthemothodswereclinicallyusedtodetecttheserumantibody．TheresultsshowedthatthemethodsdevelopedwiththefourrecombinantPOMPsweresensitive，specific，accurate，andtooverCOmetheshortcomingsoftraditionalIHA，suchaslowsensitivity,subjectivejudgments，andSOon．Inthispaper,therecombinantexpressionplasmidswereCOnstructedwhichwereexpressedinE．coliBL21．ThenCOatedWimthepurifiedprotein．theindirectELISAmethodswereestablishedfordetectingtheCABantibodiesintheswinesera．ThisstudyWasthebasisforthefurtherresearchondiagnosisofswineChlamydophilaabortusinfection．Keywords：swineChlamydophilaabortus；polymorphicoutermembraneprotein90(POMP90)；diagnosis；indirectELISA；antibody2 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立缩略语表3 华中农业大学2009届硕士学位论文4 华中农、lk大学学位论文独创性声明及使用授权1弓学位论文匆如需保密。艇密时间年月日廷雨保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取樗的研究成果．尽我所知，除了文中特剔加以标往和致谢的地方外．论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得华中农韭大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师砖此进行了审定．与我一同工作的弼志对本研究所敛的任何霓献均巴在论文中儆了明确的说ql，并表示了谢意．研究生签名：栖JI毒讯时阀：川年6月，9日学位论文使用授权书本人究全了解华中农业大学关予保存，使用学位论文的规定，印学生必须按照学棱要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印剐版和电子版，并提供目录检索和阕览服务，可以采用影印．缩印或扫描筹复制手段保存、汇编学位论文。本入同意华中农业大学可以用不两方式在不同媒体上发表．传播学位论文的全部或部分内容，同时本人儇匿在其他媒体发表论文的权力．注：保密学位论文(即涉及技术秘密，两业秘密或11,请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．学位做作者娩构忙缚导师始吻札辨期：卅年川9日蚴期：∥于∥刖日 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立第一章文献综述昂一早义陬琢尬1．1衣原体及其危害1．1．1衣原体衣原体(Chlamydiaceae)是一类介于细菌和病毒之间的革兰氏阴性微生物，专性细胞内寄生，有独特发育周期。衣原体与细菌有相似之处，表现在二者都同时具有DNA和RNA，都具有由肽多糖构成的细胞壁，含有核糖体，多种活性酶和质粒，对多种抗菌药物敏感，有的菌株有噬菌体；另一方面，衣原体又表现出与病毒相似的某些生物学特性，例如二者都能通过细菌滤器，二者都不能自身合成，故只能从它们寄生的宿主细胞内获取，并在细胞内繁殖。衣原体的许多生物学特征使其隶属于细菌范畴，如发育后期是二等分分裂，具有脂多糖和蛋白组成的细胞壁，胞壁成分中含有胞壁酸，胞内有低级的细胞器核糖体，有多种代谢活性的酶类，能够进行某些简单的代谢活动。(杨宜生等，19943于恩庶等，2000；)衣原体细小呈球形，直径1．0．2．0urn，有细胞壁。在脊椎动物细胞内可簇集成包涵体，直径可达12um。衣原体易被嗜碱性染料着染，革兰氏染色阴性，用姬姆萨、马夏维洛(MacchiaveUo)，卡斯坦萘达(Castaneda)等法染色着色良好。衣原体对高温抵抗力不强，而在低温则可存活较长时间。0．1％福尔马林、0．5％石炭酸在24小时内，75％酒精数分钟，3％过氧化氢片刻，均能将其灭活。衣原体对惠而青霉素、四环素族、氯霉素、红霉素等抗生素敏感，对链霉素、制霉菌素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、万古霉素等不敏感。衣原体具有独特的发育周期，分为有感染性但代谢失活的原体(Elementarybody，EB)和非感染性但具有代谢活性的网状体(Reticulatebody，RB)两个阶段。EB接触易感宿主细胞后开始感染，并成为具有代谢活性的RB，在内含体内进行二分裂繁殖。这些内含体通过逃避溶酶体的溶解来避免宿主的内吞作用。感染后2．3dRB再变回EB，然后被溶解排出或胞外分泌完成感染过程。(杨宜生等，19943Hackstadtetal，1997；Thomsonetal，2005)。1．1．2猪衣原体病1．1．2．1流行病学猪衣原体病多呈散发、地方流行性，季节性不明显，以秋、冬季多发。不同品种，不同年龄的猪只均易感衣原体病，有报道称母猪和哺乳仔猪感染率高于育肥猪。5 华中农业大学2009届硕士学位论文病猪和潜伏感染的带菌猪是本病的主要的传染源。实验表明，用羊、牛及禽源衣原体分离株感染猪可引起猪衣原体病。定居在猪场的野鼠和野鸟可能感染携带衣原体而成为自然疫源成为本病的自然散毒者，构成对猪场的威胁。带毒种公、母猪则成为幼龄猪群的主要传染源，种公猪可通过精液传播本病。所以隐性感染种公猪危害性更大。病猪可通过粪便、尿、唾液(飞沫)、乳汁排除出病原体，流产母猪的流产胎儿、胎膜、羊水更具有传染性，通过污染水源和饲料，经消化道、呼吸道或眼结膜感染，也可以通过交配、蚊虫叮咬，直接或间接接触等途径传染。本病是典型的群居性疾病，广西猪衣原体病的血清学调查及鹦鹉热衣原体的分离鉴定在饲养管理差、饲养密度大、通风不良、卫生条件恶劣、运输、饲料营养不全、营养缺乏、饮水缺乏等应激因子的不利影响下，可以促发本病，加重病情。潮湿阴冷(相对湿度85％以上)有利于本病的传播。在大中型猪场，本病在秋冬季流行较严重，一般呈慢性经过。另一方面，由于此病多呈慢性过程而不被人们重视，但随着病原体的猪体的多次传代，衣原体毒力不断增强。在外界气候突变，饲养密度高，通风不良，卫生条件差等不利应激因素刺激下，猪群可出现急性暴发流行。因此，持续地潜伏性传染是猪衣原体病的重要流行病学特征。另外，衣原体病还可以诱导继发感染霉形体病等，因此在其他疫病的发生上具有“前导作用”。1．1．2．2临床症状猪衣原体病是一种多征候性传染病，临床表现怀孕母猪流产、早产、产弱仔、死胎和木乃伊胎；母猪产后子宫炎、阴道炎、不发情、不易受孕；仔猪肺炎、肠炎、心包炎、脑膜脑炎、多关节炎和结膜炎；公猪睾丸炎、附睾炎、尿道炎；育肥猪成年猪结膜炎等症状。有的猪场母猪有流产产弱仔死胎，但哺乳仔猪、断奶仔猪、保育猪及中大猪未见临床症状。其中，猪衣原体性流产和引起仔猪大批死亡的衣原体性肺炎一肠炎是猪衣原体病的两大临床表现，对集约化养猪业危害相当严重，已引起养猪界越来越多人的关注。1．1．2．3病理变化病死母猪可见胸腹腔大量积液。心包积液，心外膜有点状出血。肝脏充血肿大，质地变脆，上有灰白色斑点。肺脏肿大，水肿，有纤维素性渗出物，表面有大量小出血点和出血斑，有的有脓性坏死灶。肾脏充血及点状出血，有的有灰白色斑点。腹股沟及颌下淋巴结胶冻样水肿。子宫内膜水肿、充血，分布有大小不一的坏死灶(斑)，剖检流产胎儿和病死新生仔猪，可见头颈和四肢出血，头、胸等皮下结缔组6 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体柃测方法的建立织水肿。体腔中有红色渗出液，肝脏呈黄色，充血、出血和肿大，质脆易碎，表面有灰白色斑点，肺充血，肾脏苍白，有的有点状出血，眼膜下有散在出血点，肠结膜发炎而潮红，小肠淋巴结肿胀，关节肿大，关节腔内充满灰黄色纤维素性渗出物。架子猪主要以纤维素性腹膜炎和胸膜炎为主要特征。患病种公猪睾丸变硬，有的腹股沟淋巴结肿大。输精管出血，阴茎水肿、出血或坏死。对衣原体性肺炎猪剖检，可见肺叶肿大，肺表面布有出血点和出血斑，有的肺充血或淤血，质地变硬，在气管、支气管内有多量分泌物。对衣原体性肠炎仔猪尸检，可见肠系膜淋巴结充血、水肿、肠粘膜充血出血、肠内容物稀薄，有的红染，肝、脾肿大。对多发性关节病例局部剖检，可见关节周围组织水肿、充血或出血，关节腔内渗出液增多。1．1．3流产嗜性衣原体对猪的危害1．1．3．1流产嗜性衣原体对猪的致病性流产嗜性衣原体能导致母猪流产，也能够导致公猪和其它动物、长期与患畜接触的人群患病。初产母猪感染后流产率可达40％以上。妊娠母猪感染后在怀孕后期突然发生流产、早产、产死胎、木乃伊胎或弱仔。感染过的经产怀孕母猪发病率较低，但是种公猪感染后通过精液持续排毒，配种后经产母猪群会发生群发性流产(杨宜生等，1994；邱昌庆，1998；邱昌庆，2003；邱昌庆，2004)。新生仔猪和架子猪表现为肺炎、肠炎、脑炎、结膜炎或多发性关节炎等症状。公猪多表现为尿道炎、睾丸炎、附睾炎，精液品质差，精子活力明显下降，母猪受胎率下降，受孕后流产死胎率明显升高。怀孕妇女感染后表现严重的进行性病变，如发热、伴发弥散性血管内出血。有报道同羊直接接触的孕妇感染流产嗜性衣原体并导致流产(Buxton，1986)。1．1．3．2猪流产嗜性衣原体病的流行美国WiUigan(1955年)等从患心包炎病猪病料分离出衣原体。罗马尼亚Sorodok等(1958年；1965年)报道了猪群感染衣原体后发生肺炎、大批母猪流产及新生仔猪死亡。随后，德国、前苏联、英国和日本等也陆续报道表现猪衣原体病的出现。90年代以后猪衣原体感染的报道逐渐增多。美国Woolen等在1990年调查了18头怀孕母猪产下的186头仔猪，新生仔猪陆续死亡，仅存活50头。他们从死亡仔猪的病料中只分离出衣原体，而在此之前衣原体并不在他们的考虑范围之内(杨琪，2006)。1982年，杨宜生等报道了国内猪群中此病的发现，并从流产母猪和多发性关节炎仔猪病料中分离到衣原体。随后在青海、广西、福建、四川和东北三省等地都分7 华中农业大学2009届硕士学位论文离得到该病原。(邱昌庆等，2003)表1-1我国不同省份猪衣原体感染状况Table1-1ActualityofinfectionofCpsindifferentareasinChina省份样品数阳性数阳性率(％)病原分离资料来源及时间作者1986．2002年，邱昌庆等对全国17个省的总共17448份猪血清进行检测后发现，衣原体抗体较高的地区为四川、黑龙江、江西高安、辽宁、青海格尔木和甘肃。(邱 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立昌庆等，2003)。(见表1．1)。何启盖等(2000)对湖北、广东、河南、江西、海南31个猪场444份血清的检测结果表明，衣原体抗体阳性率平均为17％，部分猪场高达75％。罗建等(2006)分别于1999．2001年和2003．2005年期间对闽西地区规模化猪场进行了血清学检测，结果发现衣原体抗体平均阳性率分别为48．1％和34．4％。1．2流产嗜性衣原体病原学研究1．2．1流产嗜性衣原体分类地位传统的分类方法中，衣原体(Chlamydia)属于原核细胞界、薄壁菌门、未定纲(和立克次氏体并列)、衣原体目；目下仅有一个科：衣原体科；科内仅有一个属，即衣原体属；属内分4个种，即肺炎衣原体(Cpneumoniae)、鹦鹉热衣原体汇psittaci)、沙眼衣原体(C．trachomatis)和家畜衣原体(Cpecorz．1m)。引起牛、羊等哺乳动物流产的衣原体属鹦鹉热衣原体血清1型(Fukuslli，1987；于恩庶，2000：朱其太，2000)。随着生物学技术的发展，许多学者根据菌株16S和23SrRNA基因序列对衣原体进行了重新分类，衣原体目(Chlamydiales)包括4个科，其中衣原体科(Chlamydiaceae)所有种16SrRNA基因同源性大于90％，而将同源性只有80％．90％的种划归第二至四科。衣原体科包括衣原体属(Chlamydia)和嗜性衣原体属(Chlamydophila)，共有9个种：鼠衣原体、猪衣原体、沙眼衣原体、流产嗜性衣原体、鹦鹉热嗜性衣原体、豚鼠嗜性衣原体、猫嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体和肺炎嗜性衣原体。其中嗜性衣原体属中各种的23S。rRNA基因序YU>95％。传统分类法中衣原体的4个种在新的分类方法中均属于衣原体科。(Petterssonetal，1997；Everettetal，1999；朱其太，2001：邱昌庆，2000；BushandEverett，2001)。这样，导致牛、羊、猪等哺乳动物流产的衣原体与导致禽、人鹦鹉热等呼吸道症状的衣原体分属不同的种，从而解决了目前衣原体分类状况混乱的局面。9 华中农业大学2009届硕士学位论文衣原体目(chlamydiales)衣原体属(Chlamydia)衣原体科(Chlamydiaceae)沙眼衣原体(C．trachomatia)鼠衣原体(C．Muridarum)猪衣原体(C．suis)嗜性衣原体属(Chlamydophila)流产嗜性衣原体(C．abortus)鹦鹉热嗜性衣原体(C．psittaci)肺炎嗜性衣原体(C．pneumoniae)反刍动物嗜性衣原体(C．Decorum)猫嗜性衣原体(C．felis)图1-3衣原体的分类Fig．1-3ClassificationofChlamydia1．2．2流产嗜性衣原体基因组研究流产嗜性衣原体全基因组全长1．14Mb，双链DNA，包含961个已经预测的编码序列，其中842个在豚鼠嗜性衣原体和肺炎嗜性衣原体中属于保守序列。保守的核心区域中存在多个高度变异的蛋白基因，如POMP家族编码基因，它们可能是CAB宿主多样性和引起流产等相关疾病的原因之一。同时，CAB缺乏一些毒素基因，以及参与色氨酸代谢和核苷拯救的相关基因，暗示其功能改变的遗传基础又不同于其他种的衣原体。(Thomsonctal，2005)。1．2．3流产嗜性衣原体主要基因与蛋白质研究衣原体表面外膜复合物(Chlamydialoutermembranecomplex，COMC)主要包括：热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)、脂多糖(Lippolysaccharide，LPS)主要外膜蛋白(Majoroutermembraneprotein，MOMP)、多型性外膜蛋白家族(Polymorphicmembraneproteinfamily，POMPs)、和富含半胱氨酸的OMP．2蛋白(Cystein·richprotein，Crp)等。lO 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方泫的建立1．2．3．1外膜蛋白基因及其编码蛋白质MOMP大小为40KDa，占衣原体外膜蛋白的60％以上，它通过二硫键的连接使衣原体成为一个整体，同时也是衣原体粘附真核细胞的工具，在衣原体感染方面具有重要的作用(Caldwelletal，1981；Tanetal，1990；Penttilaetal，2000：Igietsemeetal，2002)。MOMP能够诱导中和抗体的产生；MOMP中含有种、亚种和型特异性表位，用其制成的疫苗可对多种血清型和亚型的衣原体产生保护力(Baehretal，1988；LongbottomandLivingstone，2006；HeCetal，2007)。OMP．2蛋白具有多个半胱氨酸残基(Cys)，在衣原体外膜复合物中，这些Cys残基之间及其与MOMP蛋白的7~9个Cys残基之间可形成广泛的二硫键交叉连接。目前OMP．2蛋白的编码基因已经被克隆和测序。1．2．3．2多型性外膜蛋白基因及其编码蛋白质多型性外膜蛋白编码基因包括pomp89A、pomp90A、pomp91A、pomp90B和pomp91B。pomp90序列全长2520bp，pomp91序列全长2544bp其产物约为90kDa的蛋白质，这些蛋白质数量虽然很少，但在基因和氨基酸水平上具有较高的同源性，氨基酸的N端外露，C端指向内部，可以产生很高的免疫活性，POMP蛋白是一种良好的免疫候选抗原(Longbottometal，1996；Vretouetal，2003)。POMP蛋白N断糖基化，外切糖苷酶分析表明POMP外表面的一些寡糖可能保护多肽免受蛋白水解酶水解，而105kDaPOMP相关蛋白中的寡糖是内向的，可能表现为多糖链易受蛋白酶作用，POMP中的N连接寡糖可能作用是促进适当的折叠和蛋白的加工。pomp基因具有很强的种特异性，在其他衣原体中未发现其同源序列，其蛋白能区分流产嗜性衣原体和其他类型衣原体的感染，利用POMP的多个不同小片段建立的ELISA抗体检测方法与补体结合试验相比较，具有更高的敏感性和特异性，且POMP90．3和POMP90-4这两个小片段在敏感性和特异性方面最佳，具有较强的应用价值(Longbottometal，2001：Longbottometal，2002)。1．2．3．3热休克蛋白基因及其编码蛋白质热休克蛋白是一种分子伴侣，参与蛋白的折叠、伸展、转移，蛋白复合体(如免疫球蛋白、主要组织相容性抗原等)的组装、分解等，并且具有高度的免疫原性。(Srivastavaetal，1998；ZugelandKaufmama,1999)70KDa和57I①a的DnaK蛋白和GroEL蛋白均属于热休克蛋白，前者具有一段发 华中农业大学2009届硕士学位论文挥类似大肠杆菌启动子功能的保守序列，有三个抗原表位；后者是衣原体属特异性抗原，与大肠杆菌的GroEL蛋白极其相似，能使致敏的豚鼠和猴发生迟发型变态反应，这种蛋白可能是限制衣原体传统疫苗开发利用的一种因素。(Morrisonetal，1989,Engel，1990)1．2．3．4脂多糖脂多糖(LPS)存在于衣原体感染细胞膜表面，缺乏O多糖和部分核心多糖，带有一个属特异性抗原决定簇，长期应用于衣原体的血清学诊断。有证据表明，LPS在衣原体生长时合成过剩，从包含体中释放出来到达细胞膜上。(Bradeetal，1986)1．3流产嗜性衣原体病的防治控制衣原体感染最有效的措施是接种疫苗，但目前还没有完善的、商品化的疫苗，因此必须采取综合措施进行预防。保持动物圈舍清洁，经常消毒；定期监测种畜群和重点疫区的畜群，及时隔离治疗或淘汰抗体阳性患畜：严格处理流产的胎儿及其排泄物、病畜及可疑病畜尸体等。对于衣原体早期感染常用四环素、土霉素、金霉素等抗生素进行治疗，但由于衣原体的细胞内寄生性、其引起感染的潜伏性和持续性，以及长期使用会产生耐药性等，使用抗生素并不能从根本上控制该病。1．4流产嗜性衣原体病诊断方法研究1．4．1病原学方法1．4．1．1病原的分离培养长期以来鸡胚或细胞接种试验是衣原体诊断的主要方法。无菌采集流产母畜的胎盘、阴道拭子或者粪便、死胎的肝、肺等样品，研磨粉碎后制成10％的悬液，卵黄囊接种6．8同龄SPF鸡胚，观察鸡胚死亡情况，衣原体接种的鸡胚一般4．10d死亡。也可接种McCoy、BGM、BHK细胞等，采用姬姆萨染色法、碘染色法、荧光或者酶免疫组化方法检测特征性包含体的存在。(杨宜生等，1994；Salinasetal，1995；端青等，2003)但该方法存在时间较长、工作量大、检测结果易变性、难于获得高质量的诊断材料等缺点，在实际生产中受到很大限制。1．4．1．2病原的鉴定把可疑病畜的胎盘等病变组织直接抹片或者将分离培养的卵黄囊膜制成抹片，再通过姬姆萨染色法、碘染色法、改良萋．尼氏染色法等进行染色(细胞培养物可以12 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建屯直接染色)，然后在显微镜下进行观察，在绿色背景下有粉红色包含体存在为阳性。(端青等，2003)OIE推荐的诊断方法是直接免疫荧光试验(ImmunofluorescenceAssays，IFA)，将荧光标记的多克隆抗体或单克隆抗体滴加到组织抹片或者细胞片，37"C湿盒孵育30min，用PBS冲洗3次后自然晾干，在荧光显微镜下进行观察，可见绿色荧光的包含体即为阳性。1．4．2血清学方法1．4．2．1补体结合试验(Complementfixationtest，CFT)CFT在过去50多年间是主要血清学诊断方法，也是OIE推荐的经典的诊断方法，广泛应用于衣原体流行病学调查。但其检测需要专业技术知识且步骤繁琐，限制了其在临床中的应用。(杨宜生等，1994；于恩庶等，2000)1．4．2．2间接血凝试验(Indirecthemagglutinationtest，IHA)IHA是将抗原或抗体吸附于红细胞表面使之致敏，然后与其相应的抗体或抗原作用，在适宜的电解质存在的环境中，致敏红细胞发生被动的特异性凝集。湖北省农科院畜牧兽医研究所和中国农科院兰州兽医研究所分别研制了商业化的试剂盒，其敏感性较好，该试剂盒已在全国被广泛应用进行衣原体病的流行病学调查。(杨宜生等，1994：于思庶等，2000)1．4．2．3间接免疫荧光试验(Indirectmicroimmunofluoresceneeassays，IMIF)一一Sanderson等(1994)利用IMIF检测182份绵羊胎儿血清，结果表明其灵敏度显著优于CFT。但由于IMIF也存在着操作繁琐、特异性差的缺点，简单易于操作的诊断方法有待开发。1．4．2．4酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)ELISA是一种常用的血清学检测方法，具有特异、敏感、快速、准确、实用性强等特点，在血清学诊断方面已经进行了较广泛的研究。Cevenini等(1984)、Anderson等(1995)利用纯化的衣原体原体(EB)建立了ELISA检测方法(Ceveninietal，1984；Andersonetal，1995)。Gri衔ths等(1996)使用纯化的衣原体表面抗原脂多糖建立了ELISA检测方法，并与CFT进行对比，以免疫荧光试验作为对照，结果表明，ELISA敏感性显著高于CFT。MOMP蛋白具有血清型、亚种、种和属特异性抗原决定簇。Kaltenboeck等(1997)通过合成MOMP可变区中具有免疫活性的肽抗原，建立了间接ELISA方法检测反刍 华中农业大学2009届硕士学位论文动物的CAB感染，与LPS．ELISA、EB．ELISA及CFT等方法相比，该方法敏感性更高，而且更容易标准化。陈红英等(1995)用衣原体属特异性抗原建立Dot．ELISA方法检测猪血清抗体，并与CFT进行比较。结果表明该方法特异性、重复性好，操作简便，不需特殊仪器，肉眼易于判断。谢琴等(2001)采用衣原体单克隆抗体建立夹心ELISA方法，对宁夏地区128份羊血清、90份牛血清、231份猪血清进行检测，结果阳性率羊为25．8％，牛为32．2％猪为30．7％；选猪、羊、牛血清各50份，用夹心ELISA方法与传统的mA试验进行比较，猪血清阳性率IHA为26％，牛血清阳性率IHA为24％，羊血清阳性率IHA为22％。Buendia等(2001)以CAB特异的80．90kDa家族部分蛋白为抗原建立了ELISA方法，采用田间血清样品进行评价，并与CFT和EB．ELISA进行比较，以免疫荧光试验作为参考。结果表明，ELISA方法敏感性为90．9％，特异性为85．9％；CFT敏感性为71．0％，特异性83．6％；而EB．ELISA敏感性为95．2％，特异性为54．2％。Rekiki等(2006)采用基于CAB重组80．90kDa家族蛋白建立的ELISA试剂盒对土耳其发生流产的2绵羊血清和山羊血清进行了检测。结果表明，试剂盒与CFT符合率只有61．1％，与EB．ELISA符合率只有65％。Lon曲oUom等(2001)以CAB重组POMP91B蛋白片段建立了间接ELISA方法，并检测1人工感染和自然感染的绵羊血清，结果表明该方法敏感性为84．2％，特异性为98．5％，敏感性和特异性都优于CFT，更适宜鉴别CAB和Cpe感染；L0n曲o№m等(2002)采用多个重组POMP90片段作为抗原建立的ELISA方法对143份分别来自人工感染CAB的绵羊、实验感染Cpe的SPF羔羊和临床未发生流产的绵羊的血清进行检测。结果表明重组POMP90．3和POMP90．4的ELISA方法更为灵敏和特异；进而用POMP90．3和POMP90-4平行检测了294份分别来自于有流产史、无流产史但高CFT阳性、无流产史但分离至UCpe的羊群血清，结果显示这两种ELISA方法均优于CFT，且POMP90—4ELISAL卜,POMP90-3ELISA更敏感。(LongboRometal，2001；Lon曲ottometal，2002)Hoelzle等(2004)以CAB、Cpe和C．suis的重组MOMP蛋白作为包被抗原建立了ELISA方法，并分别检测了CAB免疫的母猪血清、人工感染CAB的小母牛血清，结果表明血清只与CAB重组MOMP发生特异性反应。Mccauley等(2007)以POMP90·3、POMP90-4、POMP80．90和MOMP为抗原建14 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立立了ELISA方法，并用它和CFT平行检测了澳大利亚羊场的部分阴、阳性血清。结果表明，敏感性方面POMP90．3>POMP90．4>POMP80．90>MOMP>CFT；特异性方面CFT和POMP90-4>MOMP>POMP80．90>POMP90．3，。1．4．3分子生物学方法1．4．3．1PCR技术PCR技术具有敏感性好、特异性高、快速等优点，适用于羊、牛、猪和鸟类等各种动物衣原体感染情况的诊断。目前，PCR诊断的目标基因主要是16srRNA、16s-23srRNA基因座、momp基因、omp2基因和pomp基因。Denamur等(1991)研究表明，24株来源于绵羊和山羊的CAB对于小鼠模型具有侵袭能力，通过对扩增的momp基因片段采用AluI酶进行RFLP分析，只产生1种特异性类型，而Cpe表现较大的遗传异质性，12株非侵袭性分离物产生8种不同的类型。Meijer等(1997)对扩增的16s．23srRNA之间基因片断进行限制性片断长度多态性分析(RFLP)，可以在种的水平上鉴定衣原体。Sheehy等(1996)对CAB和Cpeomp2基因进行测序，结果表明5’端同源性约为70％，针对该序列设计引物，建立巢式PCR，可以对牛羊源性的CAB和Cpe进行鉴别诊断，与常规PCR扩增后再进行RFLP得到的结论相一致。Kaltenboeck等(1991)针对momp基因建立了两步法PCR检测方法，第一步使用位于momp基因非编码区的引物进行扩增，第二步以第一步扩增产物作为模板，使用第一步引物内侧的引物进行扩增。结合RFLP分析可以鉴别Cpn、Ct和CAB。Messmer等(1997)以16srRNA基因序列为目标基因建立了两步PCR方法，第一步PCR是属特异性的，第二步是多重PCR，可以鉴别Cpn、Cps和Ct。该方法灵敏度远远高于分离培养法，检测下限可低至5个包含体形成单位。苗振川等(1999)根据羊CABmomp基因序列，设计合成引物建立PCR检测方法，灵敏度可达0．1pg。采集衣原体感染山羊流产胎衣等病料提取核酸样品进行PCR检测，扩增出特异性条带；对65份自然病料进行检查，66呈阳性。Laroucau等(2001)评价了pomp基因设计引物PCR方法提高敏感性的能力，结果表明其对于CAB纯化的DNA检测敏感性至少10倍于momp基因的PCR，可作为特异性诊断嗜性衣原体的一种有价值、敏感和常用的工具，结合RFLP分析可以进行种和血清型的鉴别。Ongor等(2004)采用免疫磁分离技术(IMS)结合PCR方法检测了lO个流产羊15 华中农业大学2009届硕士学位论文群和4个非流产羊群的201份羊奶样品中的CAB。通过IMS．PCR分析，1个流产羊群的3fr)样品中得到了正确的扩增。对阳性产物采用AluI进行限制性酶切后，3份样品的图谱均与CAB$26／3相同。Markey等(2005)以衣原体16srRNA基因为模板设计的引物，建立实时定量PCR，通过对80份样本进行检测比较，常规PCR没有检测到阳性的，实时定量PCR检测到12份阳性病料，说明实时定量PCR的敏感性要高于常规PCR。Amin等(2003)采用基于16SrRNA和16S．23S间隔rRNA的降落酶实时PCR技术(TETR．PCR)，检测了可疑CAB感染的流产母羊、山羊或羔羊的252份胎盘、肝或脾组织，结果表明65份组织样品为TETR．PCR]j日性而只有56份为细胞培养阳性。采用确证性巢氏PCR对差异样品进行分析后表明TETR．PCR灵敏度97％，特异性99．5％；而细胞培养灵敏性只有84．8％，特异性100％。1．4．3．2I)NA芯片技术Konrad等(2005)采用ArrayTubee平台建立了鉴定衣原体的微芯片杂交试验。该技术涉及了塑料管组合的微芯片和酶催化的银沉淀的信号放大作用。杂交探针的设计是基于最多变的窗口途径，鉴定通常的高序列相似性的种特异性核苷酸多样性。实验证明其适用于衣原体细胞培养物的准确鉴定，可能用于临床组织的直接检测。1．5本研究的目的和意义流产嗜性衣原体病是一种重要的人畜共患病，可导致猪、牛、羊等多种动物和人发生流产，本病也能导致集约化猪场发生严重的繁殖障碍，造成较大的经济损失，因此必须对该病给予足够的重视。多年来，国内外对于该病的血清学诊断方法主要是IHA和CFT，但这两种方法均具有灵敏度低、特异性差和结果判断主观性强等缺点，限制了它们在临床中的广泛应用。近年来，国内外学者对于ELISA抗体检测方法进行了研究，取得了一定进展，认为POMP90蛋白是一种良好的候选诊断抗原。本研究将通过扩增四种不同片断大小的pomp90基因，构建原核表达质粒，进行原核表达，经过纯化复性后，以重组蛋白作为包被抗原，通过各项条件的优化，建立猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法，并初步应用该方法对送检的近千份猪血清进行了检测。结果表明，该方法均具有灵敏度高、特异性好、准确等优点，且克服了传统间接血凝试验低灵敏度、判断主观性强等缺点。本研究为进一步开发猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测试剂盒，以开展猪流产嗜性衣原体病的早期诊断和血清流行病学调查奠定基础，为更好地控制本病的流行提供手段。因此，本课题研究具有重要的理论研究价值和临床应用意义。16 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立第二章猪流产嗜性衣原体POMP蛋白的融合表达流产嗜性衣原体(Chamydophiliaabortus，CAB)是一种介于细菌和病毒之间的专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物，主要寄生于猪、牛、羊等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞内，造成生殖道黏膜受损，导致以母畜流产、死胎、弱胎，公畜睾丸炎、尿道炎、龟头包皮炎等为特征的慢性接触性传染病。本病也是引起集约化猪场繁殖障碍的主要疾病之一，可造成较大经济损失。另外CAB作为一种重要的人兽共患病病原，孕妇感染后可发生流产或者其他疾病。因此，猪流产嗜性衣原体病的诊断尤为重要。本研究通过克隆猪流产嗜性衣原体的四种不同片断大小的pomp90基因，进行原核融合表达，初步探讨融合蛋白的表达特性和免疫学活性，为下一步建立间接ELISA抗体检测方法奠定基础。2．1材料与方法2．1．1试验材料2．1．1．1质粒、菌株猪流产嗜性衣原体CP／12株由中国农业大学动物医学院保存；pGEX．KG原核表达载体及菌株E．coliDH5a、E．coliBL21由华中农业大学动物医学院保存。2．1．1．2酶及主要试剂DNALadder2000、15000，蛋白质Marker购自晶美生物工程有限公司(MBI产品)；tmlQ．10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；BamHI、HindlII限制性内切酶、T4DNA连接酶、rTaqDNA聚合酶、dNTPs为宝生物工程(大连)有限公司产品；HRP标记的兔抗猪IgG、异丙基硫代．p．D．半乳糖苷(口TG)、蛋白酶K、RNA酶A购自武汉凌飞科技有限公司；3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、TEMED、过硫酸铵、脱氧胆酸钠(DOC)、丙烯酰胺、N，N’一亚甲双丙烯酰胺、氨苄青霉素、盐酸四环素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽均为amresgA3公司产品；17 华中农业大学2009届硕士学位论文其它试剂均为分析纯。图2-1表达载体pGEX—KGFig．2-1ExpressionVectorspGEX-KG2⋯113血清猪流产嗜性衣原体病阳性血清购自中国农业科学院兰州畜牧兽医研究所。2．1．2主要试剂及溶液的配制2．1．2．1抗生素氨苄青霉素(Amp)：用灭菌ddH20配制成贮存浓度50mg／mL，过滤除菌后分装成小份，贮存于．20℃备用。盐酸四环素(删：用50％乙醇(V／V)配制成贮存浓度5mg／mL，分装成小份，避光贮存于．20℃备用。2．1．2．2细菌培养基LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl5g，溶于950mL蒸馏水中，调pH值至pH7．0--7．2，补加蒸馏水定容至1000mL。分装，121℃高压灭菌20min，常温贮存备用。LB固体培养基：按上述方法配制LB液体培养基，每100mL加入琼脂粉1．5g，121℃高压灭菌20rain，常温贮存备用或待培养基温度降至50℃左右，加入相应的抗生素后，铺制平板。待培养基凝固后，4℃保存备用。2．1．2．3大肠杆菌感受态细胞 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立取冻存的大肠杆菌菌种(DH5a或BL21)，于LB固体培养基上划线活化，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于50mLLB培养液中，置37℃250-一300r／min振摇培养至OD600-0．6左右，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，冰浴10min，于4℃5000r／min离心10min。弃上清，将离心管倒置1rain，使残留培养液流尽。加10mL冰预冷的0．1mol／LCaCl2重悬沉淀，冰浴30min后，4℃5000r／min离心10min。弃上清，沉淀中加入2mL用冰预冷的O．1mol／LCaCl2重悬。悬浮的感受态细胞可马上用于转化，如保存，可加入无菌甘油至终浓度为15％，分装O．1mL／管，．70℃冰箱保存备用。2．1．2．4质粒抽提溶液1mol／LTris-CI(pH8．0)：121．1gTris碱溶于800mLddH20中，用盐酸调pH值至8．0，定容至1L。分装后高压灭菌。0．5mol／LEDTA(pH8．O)：121．1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA—Na·2H：O)加入800mLddH20中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调pH值至8．0，定容至1L。分装后高压灭菌。10XTE(pH8．O)：100mmol／LTris-HCl(pH8．O)，10mmol／LEDTA(pH8．O)。分装后高压灭菌。溶液I：50．0mmol／L葡萄糖，10．0mmol／LEDTA(pH8．0)，25．0mmoULTris．HCl(pH8．0)，115"C高压灭菌15min，置4℃保存备用。溶液II：0．2mol／LNaOH，1．0％(mⅣ)SDS。现配现用。溶液III-5．0mol／L乙酸钾60mL，冰乙酸11．5mL，加入ddH20定容至100mL。2⋯125SDS．PAGE相关溶液5xTris-甘氨酸电泳缓冲液：15．1g强s碱，94g甘氨酸(Eg泳级，pH8．3)，50mL10％SDS(电泳级)，加入ddH20溶解定容至1L。30％聚丙烯酰胺母液：将29g丙烯酰胺及1gN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于60mLddH20中，加热至37℃溶解，定容至100．0mL，置棕色瓶中，4℃避光保存备用。10％过硫酸铵：O．5g过硫酸铵溶于5．0mLddH20中，4"C保存。1．5mol／LTris·C1①H8．8)：36．39Tris碱溶于ddH20中，用盐酸调pH值至8．8，定容至200．0mL。1．0mol／LTris-Cl(pn6．8)-24．29Tris碱溶于ddH20中，用盐酸调pH值至6．8，定容至200．0mL。19 华中农业大学2009届硕士学位论文12％SDS聚丙烯酰胺(分离胶，10mL)：3．3mLddH20，4．0mL30％丙烯酰胺溶液，2．5mL1．5mol／LTris(pH8．8)，O．1mL10％SDS，O．1mL10％过硫酸铵，0．004mLTEMED。5％SDS聚丙烯酰胺(积层胶，2mL)：1．4mLddH20，O．25mL30％丙烯酰胺溶液，0．25mL1．0mol／LTris(pH6．8)，O．02mL10％SDS，0．02mL10％过硫酸铵，0．002mLTEMED。2xSDS凝胶加样缓冲液：O．2％溴酚蓝，100mmol／LTris-HCI(pH6．8)，200mmol／L二硫苏糖醇(DTT)，4％(m／V)SDS(电泳级)，20％(V／V)甘油。二硫苏糖醇配成lmol／L贮存液，临用前加入。考马斯亮蓝染色液：45mL甲醇，45mLddH20，10mL冰乙酸，0．25g考马斯亮蓝R250，研磨混匀，过滤，置棕色瓶内保存。脱色液：45mL甲醇，45mLddH20，10mL冰乙酸，混匀。2．1．2．6Western．blot相关溶液电转缓冲液：2．9g甘氨酸，5．8gTris碱，0．379SDS(电泳级)，加200mL甲醇及ddH20定容至1000mL。TBS(pH8．0)：1．219Tris碱，8．89NaCl溶于800．0mLddH20中，用HCI调pH至8．0后，ddH20定容至1000．OraL。TBST：含0．05％Tween．20的TBS。封闭液：含1．0％(mN)BSA的TBST。1MTfis．C1(pH7．6)：24．29Tris碱溶于ddH20中，用盐酸调pH值至7．6，定容至200．0mL。底物液(新鲜配制)：6mg二氨基联苯胺(DAB)，9mL0．01mol／LTrisHCl(pH7．6)，1mL0．3％COCl2，10“L30％H202。2．1．2．7蛋白表达及纯化相关试剂溶菌酶：用灭菌ddH20配成50mg／mL，-20"C贮存备用。异丙基硫代-p-D一半乳糖苷(IPTG，分子量238．3D)-2．OgIPTG溶解在8．OmLddH20中，定容至lO．OmL，用0．22I-tm滤膜滤器过滤除菌，分装成1．0mL／份，冻存于．20。C。DTT(1mol／L)：3．099DTT溶解于20．0mL0．01mol／LpH5．2乙酸钠中，过滤除菌后分装成1．0mL／份，冻存于一20℃。缓冲液A：50mmol／LTris．HCl(pH8．0)，0．5mmol／LEDTA，50mmoYLNaCl，5％ 猪流产嗜性衣原体病间接ELlSA抗体检测方法的建立(v／v)甘油。细菌裂解缓冲液：BufferA+DTT(0．5mM／L；使用前加入)1％TritonX．100，20％(mⅣ)N．十三烷基肌氨酸钠(SKL)，20％(mⅣ)PEG-4000，均按常规方法配置。50mmol／L氧化型谷胱甘肽：1．5315g氧化型谷胱甘肽，加ddH20充分溶解，最后定容至50mL，过滤除菌，贮存于4℃备用。100mmol／L还原型谷胱甘肽：1．5367g还原型谷胱甘肽，加ddH20充分溶解，最后定容至50mL，过滤除菌，贮存于4℃备用。0．01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．3)：8．09NaCl，O．29KCl，0．29KH2P04，2．99Na2HP04·12H20，调pH至7．3，加ddH20定容至1000．0mL。洗脱液：O．1549还原型谷胱甘肽溶于50mL50mMTris．HCl(pH8．0)中。2．1．2．8其它试剂细胞裂解液：0．1mol／LTris—HClOH8．o)，0．01mol／LEDTA(pH8．O)，I％SDS，0．1mg／mL蛋白酶K。TAE(50x)-242．0gTris碱，57．1mL冰乙酸，100．0mLO．5mol／LEDTA(pH8．0)，加ddH20定容至1000mL。O．1mol／LCaCl2．55．5g无水CaCl2，加ddH20充分溶解，最后定容至500mL，过滤除菌，分装贮存于4℃备用。2．1．3试验方法2．1．3．1基因组DNA的提取取猪流产嗜性衣原体CP／12株感染鸡胚卵黄囊，加适量灭菌生理盐水充分研磨，取适量研磨液于1．5mL离心管中，3000r／min离,凸,10min，取上清，再15000r／min离心30rain，取沉淀，按细菌DNA提取试剂盒的操作步骤提取基因组。提取方法：沉淀用10倍体积细胞裂解液混匀，55℃水浴消化2h，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)进行抽提，反复抽提2次，12000r／rain离心5rain，上层水相加入2．5倍体积无水乙醇和1／10体积乙酸钠，．20℃沉淀30rain。然后12000r／min离心10mill，70％乙醇洗涤1次，室温干燥，沉淀用适量TE溶解，．20℃保存备用。·2．1．3．2PCR引物的设计与合成根据GenBank上公布的CA$26／3株pompgO基因序列，设计引物见表2．1。其中pomp90基因上下游引物中分别加入BamHI和HindIII酶切位点。所有引物均由2l 华中农业大学2009届硕士学位论文北京奥科生物技术有限责任公司合成。表2-1PCR反应引物Table2．1PrimersforPCR2．1．3．3目的基因的PCR扩增以猪流产嗜性衣原体基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。反应体系见表2．2，扩增条件见表2．3。扩增产物经1．0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。表2．2PCR反应体系Table2-2ReactionSystemforPCR试剂用量模板上游引物(109mol／L)下游引物(109mol／L)dNTPs(各2．5mmol／L)10×TaqBufferTaqDNA聚合酶(5U／p1)ddH205．OLLL1．09L2．OLLL2．5LLL0．5uL加至25uL表2-3PCR反应条件Table2．3ReactionconditionforPCR反应过程反应温度反应时间预变性94℃5min变性94。C30s、30个退火58。C30sL循环延伸72℃lminl延伸72℃10min 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立2．1．3．4PCR产物的回收纯化用DNA胶回收试剂盒回收纯化DNA，操作按说明书进行。方法：DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入1．5mL离心管中，将其切成细小胶块以利于溶解；按每100mg凝胶400}tLLL例加入BindingBuffer，56℃水浴10min，其间上下颠倒离心管2---3次，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至HiBindDNAspin．column回收柱，室温静置2min，8000r／min离心1min，倒掉收集管中的废液，加入500gLWashingSolution洗涤，静置2．3min,12000r／min离一t1,30s；加入500gLWashingbuffer，静置2．3min，12000r／min离一t],30s，去掉收集管中的液体，12000r／min离心空管1min，干燥空管，直至无乙醇气味；将回收柱转至一新的1．5mL离心管中，在回收柱中央加入20此TE(pH8．0)溶液洗脱，于室温放置5min，12000r／min离心1rain，收集管中液体即为回收的目的DNA片段，可直接用于DNA连接或于．20℃保存备用。2．1．3．5目的基因的克隆回收特异性扩增片段后，用BamHI和HindHI同时双酶切回收的PCR产物和载体pGEX．KG，回收目的片段和载体，T4DNA连接酶16。C连接12h，连接产物转化EcoliDH5a，挑取转化的菌落，接种于3mL含Amp的LB液体培养基中。37。C培养过夜，小量制备质粒DNA，经BamHI+HindlII双酶切，琼脂糖凝胶电泳，阳性质粒送交上海英骏生物技术公司测序，将构建的阳性重组表达质粒分别命名为pKG—pomp1、pKG-pomp2、pKG-pomp3和pKG—pomp4。酶切反应体系见表2_4，连接反应体系见表2．5。表2-4双酶切反应体系Table2-4Reactionsystemfordoubleenzymesdigestion试剂剂量目的基因或pGEX-KG限制性内切酶酶切缓冲液ddH：O5．0或1．09LO．59L／种1．09L加至109L 华中农业大学2009届硕士学位论文表2-5连接反应体系Table2-5Reactionsystemforlinkage试剂剂量酶切目的基因回收产物酶切pGEX—KG回收产物T4DNAligaseT4DNAligasebufferddH2010．09L1．09L1．O肛L2．01xL加至20I．tL2．1．3．6质粒的转化取．70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物(10txL)或质粒(1gL)，混匀，冰浴30min。取出，42℃水浴热击90s，迅速再冰浴5---10min后，加入500此LB液体培养基，37℃150～200r／min振摇培养45min，8000r／min离心2rain，弃去400I_tL上清，剩下的约200lxL培养液重悬菌体，均匀涂布固体培养基平板，37℃培养至单菌落出现。2．1．3．7质粒的小量制备(碱裂解法)挑取LB固体培养基上的单菌落，接种于3mL含Amp的LB培养液中，37℃300r／min振摇培养12h，菌液转入1．5mL离心管中，10000r／min离心1min，收集菌体；加入100lxL预冷的溶液I，涡旋菌体至充分悬浮，静置3～5mira加入新鲜配制的溶液II200lxL，快速上下颠倒混匀，冰浴3～5min；加入预冷的溶液III150此，快速上下颠倒混匀后冰浴5min；12000r／min离心10min，上清转移至另一离心管中，加入与上清等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，涡旋振荡或颠倒混匀；12000r／min离心10min，小心吸取上层水相至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积3mol／L乙酸钠，．20℃放置30min；4℃12000r／rain离心10rain，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，自然干燥；加入适量含RNaseA的ddH20或TE(pH8．O)中，37℃温育30min，．20℃保存备用。2．1．3．8重组表达质粒的诱导表达将pGEX．KG载体和构建的重组表达质粒分别以热激法转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，在转化的Amp平板上挑取单菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃300r／rain振摇培养8h后，置4℃12h。按1：100比例接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃300r／mAn振摇培养至菌液OD600达0．4--0．6时，加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG，继续培养3-8h，4℃5000r／min离心5min，弃上清，菌体加 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立1001．tLddH20吹散混匀，加100此2xSDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，冰浴1．5min，于12％的SDS．PAGE电泳检测重组蛋白的表达。2．1．3．9SDS—PAGE电泳以ddH20清洗玻璃板、梳子及封闭胶条等，晾干后，夹好玻璃板。将配制好的12％SDS．丙烯酰胺分离胶约5mL迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，随即在分离胶上加入一层异丁醇。待分离胶聚合后，倾出覆盖层的异丁醇，用ddH20缓慢冲洗凝胶顶部数次，滤纸片吸净残留液体。再将刚配制好的5％积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子。待胶全部聚合后拔出梳子，用ddH20洗去加样槽的残留液体。将玻板固定于电泳装置上，加入电泳缓冲液，每孔加入10""20lxL样品。将电泳装置与电源相接，电压调到80V，进行电泳。待溴酚蓝迁移到分离胶时，将电压调到120V，待溴酚蓝迁移到分离胶底部时取出聚丙烯酰胺凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中染色4h以上，取出放入脱色液中脱色数次，每次30"--60min。脱色完全后，取出观察分析。2⋯1310表达产物存在形式的检测诱导表达的细菌培养物在4℃8000r／min离心5min，收集沉淀，加1／10原培养物体积的缓冲液A重悬，反复冻融2～3次，冰浴中强超声波处理约8次，10s／次，直到液体透明。4℃12000r／min离心10min，取100此上清备用，沉淀加等体积(离心前)缓冲液A重悬，取1001．tL重悬液加100lxL2xSDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，与破菌后的上清一起进行SDS．PAGE，确定表达产物是以可溶(上清)还是不溶(包含体)形式存在。2．1．3．11可溶性表达产物的提取诱导表达的细菌培养液4℃12000r／min离心10min，收集沉淀，以1／10原培养基体积的缓冲液A重悬，高强超声波处理至液体透明。4℃12000r／min离心lOmin，弃沉淀。将上清采用GlutathioneSepharose4B胶(GEHealthcareCo．)进行纯化，SDS．PAGE检测纯化后的样品，．20℃分装保存。2．1．3．12不溶性表达产物(包含体)的纯化和复性取诱导表达后的菌液，4℃8000r／rain离心5min，收集沉淀，以1／10原培养基体积的缓冲液A重悬，高强度超声波处理至液体透明。4℃12000r／min离心10min，弃上清。沉淀用PBS(pH7．4)洗涤2次后，加入19．7mL缓冲液A及0．3mL20％的N一十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶液，剧烈搅动，室温静置2h，使沉淀缓慢溶 华中农业大学2009届硕士学位论文解。4℃12000r／min离心10min，弃沉淀，上清中加入终浓度为0．2％的PEG4000，终浓度为1．0mmol／L的氧化型谷胱甘肽及终浓度为2．0mmol／L的还原型谷胱甘肽，充分混合均匀，室温静置2h。用PBS(pH7．4)在4。C下进行透析复性3天，并用磁力搅拌器搅拌，其间换PBS数次。取出后用核酸蛋白测定仪检测蛋白浓度，分装，．20℃保存备用。2⋯1313Western．blot试验当SDS．PAGE电泳将结束时，用蒸馏水清洗石墨板，滤纸吸干。剪取与凝胶大小相等或略小的6张滤纸和1张硝酸纤维素滤膜(NCM)。先将NCM漂浮于ddH20上使之润湿，再将NCM完全浸没于ddH20中，浸泡5min以除去NCM上残留的气泡，用软铅笔在NCM一角做标记。安装转印装置，平放底部阳性电极，石墨一边朝上，放置3张电转缓冲液浸泡过的滤纸，精确对齐，以玻璃棒赶出气泡，把NCM放在滤纸上。取下凝胶，在ddH20中漂洗后精确平放于NCM上，凝胶左下角与NCM标记对齐，排除气泡。把另外3张滤纸放在凝胶上方。将阴性电极盖上，接通电源，转印1．5—2h。转印结束后，将NC膜于TBST中漂洗一下，再将NC膜转入可加热密封的塑料袋中，按O．1mL．0．15mL／cm2(NC膜面积)加入封闭液，尽可能排尽袋内的气泡后，加热密闭袋口，室温平缓摇动1．2h或4。C过夜。然后弃封闭液，将膜取出，将膜转入新的塑料袋中，按O．1mL．0．15mL／cm2的量加入经TBST稀释(1：150)的猪阳性血清，同上排除气泡并密封袋口，在摇床上室温作用lh，TBST洗3次，每次5mim，再用TBS洗膜3次，每次5min。将膜转入新塑料袋中，按O．1mL．0．15mL／cm2加入经TBST稀释(1：1000)的兔抗猪IgG—HRP，室温反应lh，TBST洗3次，每次5min，再用TBS洗膜3次，每次5min，加入以0．01mol／LTris．C1(pH7．6)配制的底物溶液(DAB．n202)显色，一旦出现蛋白带，立即用ddH20终止，即可观察并照相。2．2结果与分析2．2．1pomp90基因的克隆以猪流产嗜性衣原体CP／12株基因组为模板，用特异性引物通过PCR进行扩增，经基因测序和Blast比对后证实获得了目的基因：包括1077bp的pompl基因(Genebank登录号EU660310)、1212bp的pomp2基因、240bp的pomp3基因和204bp的pomp4基因。PCR结果见图2．1。 鞯流产嗜性在厦体旃间接ELISA抗体检测方法的建立2．2．2重组原棱表达质粒的构建猪流产嗜性衣原体不同片断大小pomp基因PCR产物和pGEX·KG载体经双酶切回收后进行连接，转化后经双酶切和基因测序鉴定．表明成功构建了重组质粒pKG-POMPl、pKG-POMP2、pKG·POMP3和pKG·POMP4。酶切结果见图2-2。pompl2000bp1OOO岫750bp500bp250bp100bp2000b9l000岫．750bppomp。,500bp250bp100bppo,n州M2000bp1∞Obp750bp500bp250bp2000bpl0∞bp750bp500bp250却1011却图2-1目的基因PCR结果Fig．2-1PCRoftargetgeneM分子盘标准DNAmark。,1PCR产物ece．product 毕中农业大学2009届硕±学位论文5O∞bp3000bp2000bp1000bp750bp500bppomp312譬一—-●●●-12mipq25ooobp3oooh2000h口1coobp750bp500卸250bp100bpl2125000bp3000b2∞Obp1O∞bp750b口500b口5000bpl000bp750bp5∞bp250bp100b口图2-2重组质粒的酶切鉴定n晷2-2Identificationofrccombiaantplasmid1酶切后的重组质粒EnzymeSgestionofrecomblnantplasmid2分子量标准DNAmarker2．2．3重组质粒pKG．POMP的原核表达及反应原性检测2．2．3．1重组质粒pKG-POMPI的表达及反应原性检测将pKG-POMPl转化丘coliBL21后经诱导表达得到大小为65KDa的特异蛋白．经Wcstcm-blot分析证实目的蛋白能与猪流产嗜性衣原体阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有良好的反应原性。结果见图2．3。超声破碎后离心分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，证实表达蛋白主要以包含体形式存在。提取纯化包古体，蛋白复性透析，测定浓度后冻干保存备用。 猪流产嗜性袁原件病间接ELISA抗体检捌方※的建^Ml234594＆Da⋯669Da．。一纛霉圈18KDa～嚣=图2-3重组POMPI蛋白SDS-PAGE和Westera-blot结果Mg．2-3SDS-PAGEandWestern-blotofreeombiaantPOMPIproteinI一3：SDS-PAGE结果ResultsofSDS-PAGEM蛋白质标准分子质量proteinillarkcr；1．空载体表达产物expre魑ionpxoductsofvector；2重组质粒诱导前豫Ⅻ曲in枷讯as面dbeforeinduction；3重组质粒诱导后表达产物expremmproductsofrecombh圳tplasmldafarinduction：¨Western-blot结果ResultsofWestern-blotf4空载体表选产物e郴ion删uccsofvecaor=5重组POMPI蛋自#OMP]protein)22．3．2重组质粒pKG-YOMP2的表达及反应原性检测将pKG-POMP2转化大肠杆菌BL21，于诱导前和诱导后3各取1．0mL菌液，菌体裂解物经12％分离胶进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示：诱导3h后可见太小约为65KDa的融合表达蛋白(图2_4)。Western-blot证实融合蛋白GST-POMP2可与猪流产嗜性衣原体附性血清发生特异性反应。菌体经超声破碎后SDS—PAGE发现，融合表达蛋白主要阻包含体形式存在，且通过纯化处理后，几乎没有其它杂蛋白(图2．5)。蛋白纯化后冻干保存各用。11j，—习1JIF酸黟E。孟‘o。k隧～a如妯∞非站” 毕中农业人学2009屉颤十学位论文94KDa66KDa45KDa35KDa25KDa18KDa■-图2_4重组POMI'2蛋白SDS-PAGE结果Fig．2-4SDS-PAGEofrecombinantPOMP2M蛋白质标准分子质量lymtelnIilarkez-；l空载体表达产物expre辅ionproductsofvector：2重组质粒诱导前recombinantflasnⅢdbefoleinduction：3-8重组质粒诱导3后表达产物“pressionproductsofrecombinantdasIDidinducingfor3h94KDa66KDa45KDa图2-5重组POMP2蛋白表达形式和Westernblot检测结果F‰2-5ExistentformandWestern·blotofrecombinantPOMnM．蛋白质标准分子量Protelnmarker；,1菌体破碎后的上清s唧mm咖tofBL2tcentalningpKG-POMP2tleatedwithultr蛆obicwave；2菌体破碎后的沉淀DepositlonofBL2tcontainingpKG-POMP2Ueatedwithuhasonjcwavf：3纯化后的重组POMP2PmifiedrecombinantPOMP2；4-5，w侧瞄渊m结果Re州bofWestern-blot(4空载体表达产物既删彻舯讪I廿sofvector：5重组POMP2蛋白rPOMP2protein) 猪流产嗜性袁原体病间接ELISA抗体检测方法的建立2．2．3．3重组质粒pKG-POMP3的表达及反应原性检测pKG-POMP3在分子量约35KDa处表达一条特异性蛋白条带，与预期大小基本一致。将pKG-POMP3诱导3h后的产物和空白载体的表达产物进行Western-blot分析。结果表明诱导的pKG-POMP3与猪流产嗜性衣原体阳性血清发生反应，出现特异性条带，而空白载体未出现反应条带，证实融合表达蛋白具有较好的反应原性。见图2_6。M1234545KDa35KDa25KDa围2-6重组POMP3蛋白的表达和Westernblot活性鉴定Flga-6ExpressionandWestern-blotofrecombinantPOMP3proteinM蛋白质标准分子质量protmrnⅢk盯；l空载体表达expressicm。productofveclor：2重组质粒诱导前recombinantplasmidbefor=induction；3．重组质粒诱导后表达产物expressionixoducBofrecombin蛐tplasmidal谊induction；45：Western-blot结果ResultsofWestern-blot(4重组POMP3蛋白rPOMP3ixotem=5空载体表达产物expressionproductsofveccon诱导表达后的菌体经超声裂解后离心，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明表达产物位于上清中，通过GlutathioneSepharose4B胶纯化蛋白，能得到较高纯度的目的蛋白。2．2．3．4重组质粒pKG-POMP4的表达及反应原性检测pKG-POMP4成功表达，大小约为32KDa，与预期大小基本一致。将pKG-POMP4诱导3h后的表达产物和空白载体的表达产物进行Western-blot分析。结果诱导的pKG-POMP4与猪流产嗜性在原体阳性血清发生反应．出现特异性带，而空白载体未出现反应条带，证实表达的融合蛋白具有较好的反应原性。表达菌体经超声裂解撩拣骥鬻誓琴≤糕嚣～{I零一。。}j毒媾。一鋈 毕中农n^学2009届硕士学位论文后离心，取上清和沉淀分别进行SDS．PAGE电泳分析，表达产物位于上清中，通过Oluta日oioneSepharose4B胶纯化蛋白，能得到较高纯度的目的蛋白。见图2-7·94KDa66}￡Da45I∞a35KDa25I∞a图2-7重组POMP4蛋白表达和WesterR-blot结果rig．2-7ExpressionandWestern-blotofrecombinantPOMP4proteinM蛋白质标准分子质量prvleinmad叮：l空载件表选exxonofvca吣2重组质粒诱导前础瑚nb㈣山砌诅be妇℃inducfiom3重组质粒诱导后表达产物expfessionproductsofrecomblnantplasnfidafterinductioa；4-5：Western-blot结果P,esulLsofWestern-blotH重组POMP4蛋白rPOMP4proton：5空载体表选产物即ducBofvector；)2．3讨论2．3．1原核表达载体的选择本研究选择质粒pGEX-KG作为原核表达载体，该载体利用乳糖操纵子调控模式，启动子是由廿p启动子的-35序列和IacUV5的Pribnow序列拼接而成的Ptae，与lac相比，其mRNA转录水平、表达水平更高。携带pGEX-KG质粒的太肠杆菌能表达GST，而GsT与表达的外源蛋白质融合后，能增强外源蛋白质在宿主细胞中的稳定性，避免蛋白酶的水解；有利于外源蛋白质高效表达；增加其溶解度；融合表达产物往往容易在胞质中聚集形成包含体，有利于提取和纯化。与其它宿主相比，大肠杆菌具有遗传背景和生化特性清楚，易于操作、培养周期短，培养成本低，易于制备等特点。我们构建的四种重组表达质粒在E∞打中获得了高效稳定的融合表达，表达的目的蛋白均以与标签融合的方式表达。本试验通，l羹l{：萋誊=善。=惭赣纛墨M一螂～懈 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立过对表达后菌体的破碎和离心处理，再用上清与沉淀同时进行SDS．PAGE检测，发现所大片段的目的蛋白(POMPl和POMP2)绝大部分都在沉淀中，而且表达量比较大。而小片段重组蛋白(POMP3和POMP4)则主要位于破碎后的上清中，这为我们的纯化工作提供了方便。以上结果表明大片段的POMP容易聚集形成不溶性包含体，而小片段重组蛋白则主要以可溶的上清形式存在。2．3．2融合蛋白的表达及包涵体的提取包涵体是外源蛋白高效表达时的普遍现象，且包涵体中重组蛋白是部分变性的，因此不具备生物学活性，需经过变性溶解后，在适当条件下复性，使重组蛋白折叠成天然构象状态，才可恢复其生物活性。因此，本研究用bufferA溶解纯化的包涵体后，加入20％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl，SKL)作为变性剂，变性后离心发现离心管底部几乎没有任何沉淀，说明包涵体溶解非常彻底。SKL是一种温和的阴离子去垢剂，可溶解许多包涵体蛋白，目前应用较为广泛。变性后的蛋白质必须除去过量的变性剂和巯基还原剂(如DTT)，并在氧化的环境中，促使天然蛋8--硫键的生成。常用的方法有稀释、透析、渗滤等，本研究采用透析法选择谷胱苷肽复性系统来复性目的重组蛋白，并在系统中加PEG．4000来提高复性后重组蛋白的产量。复性后的重组蛋白经Westem-blot分析，发现重组融合蛋白具有较好的免疫活性。2．3．3融合蛋白的免疫活性本试验以流产嗜性衣原体CP／12株基因组作为模板，设计引物PCR扩增了四种不同片断大小的POMP90蛋白编码基因，并进行了克隆和原核表达。融合表达产物蛋白通过Western．blot分析显示与CAB阳性血清发生特异性结合反应，表明具有较强的免疫学反应原性。因此，从理论上分析均可作为CAB血清学检测的抗原。33 华中农业大学2009届硕士学位论文第三章猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立流产嗜性衣原体是一种重要的人畜共患病病原，可引起猪、牛、羊等多种动物和人发生流产。本病也是引起集约化猪场繁殖障碍疾病的主要病因之一，必须进行严格预防和控制。长期以来，国内外对于猪流产嗜性衣原体病的血清学诊断主要采用间接血凝试验和补体结合试验来进行，但这两种方法均存在着灵敏度低、特异性差和结果判断的主观性等缺点，应用中受到一定限制。国内外学者对于ELISA抗体检测方法进行了研究，并取得了一定成果，并且认为位于衣原体外膜的POMP90蛋白作为检测抗原具有良好的发展前景。流产嗜性衣原体POMP家族蛋白是一类具有较高种特异性的免疫原性蛋白，具有种、属特异性，可区分流产嗜性衣原体与其他类型的衣原体。LongboRom(2001；2002)采用基于重组POMP90蛋白的不同片断建立了间接ELISA方法，结果表明基于重组POMP90．3和POMP90．4的ELISA方法在灵敏性和特异性方面均优于CFT和基于重组MOMP蛋白建立的ELISA方法，以其建立的针对反刍动物的ELISA诊断试剂盒已经投入临床使用。POMP蛋白成为流产嗜性衣原体免疫诊断研究新的焦点。本研究的目的旨在建立以POMP蛋白为包被抗原，检测猪流产嗜性衣原体病抗体的间接ELISA方法。本研究的研究结果将为进一步开发猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测试剂盒，以便开展本病的早期诊断和血清流行病学调查，以便更好地控制本病的发生提供手段。3．1材料与方法3．1．1材料3．1．1．1病毒日本乙型脑炎(JE)、猪伪狂犬病(PR)、猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)等常见猪繁殖障碍性疾病的阳性血清由华中农业大学动物传染病室提供。3．1．1．2衣原体间接血凝试剂盒购自中国农业科学院兰州畜牧兽医研究所3．1．1．3猪血清样品的采集样品采自湖北、河南、安徽、广东的规模猪场和部分散养户，共采集血清968 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立份，这些血清包括公猪、母猪及不同日龄的仔猪，用于检测血清中CAB抗体，分析猪场CAB的感染情况。3．1．1．4主要试剂兔抗猪IgG—HRP由武汉博士德生物公司提供；牛血清白蛋白(BSA)：购自武汉亚法生物技术有限公司，．20℃冰箱保存；猪流产嗜性衣原体病阳性血清购自中国农业科学院兰州畜牧兽医研究所。3．1．1．5间接ELISA相关试剂的配制包被液(25mmol／L碳酸盐缓冲液，pH9．6)：1．599Na2C03，2．939NaHC03，加ddH20至1000mL，4。C保存备用。洗涤液(0．05％Tween一20PBS，pH7．4)：8．09NaCl，0．29KCl，2．99Na2HP04·12H20，O．29KH2P04，0．5mLTween-20，加ddH20至1000mL。封闭液：1．09BSA溶于100mL洗涤液，4。C保存备用。底物液A：0．29TMB溶于100mL无水乙醇，4"C保存备用。缓冲液B：Na2HP0414．6g，柠檬酸9．33g，0．75％过氧化脲6．4mL，加ddH20至1000mL，调pH5．0，4。C保存。底物液(n肥．过氧化脲溶液)：底物液A稀释10倍与B等体积混合。终止液(2mol／LH2S04)：浓H2S04100mL，加ddH20至900mL。3．1．1．6主要实验器材EXE800酶联免疫吸附检测仪：BIO．TEKinstruments，INC，USA96孔ELISA板，浙江省玉环县康佳医化器械厂生产。3．1．2方法3⋯121间接ELISA操作程序重组POMP蛋白以适宜浓度包被酶标反应板，每孔100gL；每孔加入200pL洗涤液，洗涤5次，每次3min；加入封闭液进行封闭，37℃1h，洗涤；加入适当稀释的猪血清，每孔100gL，37℃反应lh，洗涤；加入适当稀释的HRP标记兔抗猪IgG抗体，每孔100“L，37℃反应1h，洗涤；加入底物100pL进行显色，37℃反应10mira加入50止终止液终止反应，测定OD4s0值。3．1．2．2抗原抗体最佳工作浓度的确定四种重组POMP蛋白分别以8．oo、4．00、2．00、1．00、0．50、O．25rtg／mL进行包被，用含I％BSA的PBST进行封闭，猪CAB阳性血清和阴性血清分别做1：100、35 华中农业大学2009届硕士学位论文1：200、1：400、1：800稀释，进行间接ELISA检测。选择阳性OD450值1．00左右，OD阳性／OD阴性(P／N值)最大时的抗原包被浓度和血清稀释倍数为最佳工作浓度。3．1．2．3抗原包被条件的选择以最适抗原浓度包被酶标板，包被条件分别为：37℃1h；37℃1h后4℃12h；37℃2h；37℃2h后4℃12h；4℃12h，阳性和阴性血清按1：400稀释，其它条件相同，进行间接ELISA检测。根据P／N值确定最佳包被条件。3．1．2．4封闭液的优化选择抗原最佳条件包被，封闭液分别用含I％BSA或5％脱脂奶粉或O．5％明胶的PBST。在其他条件及操作方法相同的情况下，对阴、阳性血清进行间接ELISA检测，比较阴阳性血清的OD450值和P／N值，以确定合适的封闭液。3．1．2．5二抗最佳稀释度的确定抗原最佳条件包被，血清最佳倍数稀释，酶标二抗分别作l：2000、1：3000、1：4000、1：5000、1：6000稀释，进行间接ELISA检测，根据P／N值确定二抗最佳稀释度。3．1．2．6阳性临界值的确定随机选取44份猪流产嗜性衣原体阴性血清进行间接ELISA测定。每份样品重复两孔，计算样本OD450平均值(x)和标准差(sD)。以X+3SD作为血清阳性的临界值。根据统计学原理，当样品OD45。≥X+3SD值时，判定为阳性。3．1．2．7特异性试验(1)交叉试验按间接ELISA操作步骤，用日本乙型脑炎(JE)、猪伪狂犬病(PR)、猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PI墩S)等疾病的阳性血清代替CAB阳性血清测定OD450值，设CAB阴、阳性血清各一份作对照，每份重复三孔。(2)阻断试验将阳性血清按最佳稀释度稀释，加入等体积最适稀释度重组抗原，37℃作用1h，将上述混合液加入已包被抗原的酶标板，ELISA测定OD450值。同时设立对照组，比较结果。计算阻断率=(未阻断孔OD值一阻断孔OD值)／未阻断孔OD值。若大于O．5，则判断为阻断阳性。3⋯128批内重复试验随机选取8份阳性血清样品，用间接ELISA方法进行检测，每份样品重复6孔， 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立计算平均值(X)和标准差(SD)，变异系数(CV)=SD／X。。3．1．2．9符合性试验将临床采集的180份猪血清样品分别用间接ELISA和LHA试剂盒进行平行检测，评价其检测符合率。3．1．2．10POMP．ELISA检测方法的初步应用重组POMP蛋白以最佳浓度包被酶标反应板，每孔100lxL；每孔加入200gL洗涤液，洗涤5次，每次3min；加入含I％BSA洗涤液进行封闭，37℃1h，洗涤；加入最佳倍数稀释的临床采集的968份猪血清，每孔100此，37℃反应1h，洗涤；加入适宜稀释的HRP标记兔抗猪IgG抗体，每孔100pL，37℃反应lh，洗涤：加入底物100此进行显色，37℃反应10min；加入50pL终止液终止反应，测定OD450值。判定血清阴阳性，计算阳性率，并分析不同猪场和不同生长阶段猪血清阳性的差异。3．2结果与分析3．2．1抗原抗体最佳工作浓度的确定3⋯211重组POMPl蛋白根据方阵试验结果(表3．1)，随着抗原浓度的降低和血清稀释倍数的增大，血清的OD450值不断降低，当POMPl的包被浓度为1．00lxg／mL、血清为400倍稀释时，阳性血清的OD450值在1．0左右，且阴性血清的OD450值较低，此时P／N值最高。据此，我们确定抗原最佳包被浓度1．00I_tg／mL，血清最佳稀释倍数为l：400。3⋯212重组POMP2蛋白根据方阵试验结果(见表3—2)，当POMP2的包被浓度为1．00pg／mL、血清为400倍稀释时，阳性血清的OD450值在1．0左右，且阴性血清的OD450较低，P／N值最高。因此，确定抗原最佳包被浓度1．00gg／mL，血清最佳稀释度为1：400。37 华中农业大学2009届硕士学位论文表3．1rPOMPl抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定Table3-lDeterminaitionofthecoatingconditionofrPOMPlandserumdilution3⋯213重组PoMP3蛋白根据方阵试验结果(表3．3)，当POMP3的包被浓度为0．25lag／mL、血清为400倍稀释时，阳性血清的OD450值在1．0左右，且阴性血清的OD450较低，P／N值最高。POMP3最佳包被浓度0．25I_tg／mL，血清最佳稀释度为1：400。3⋯214重组POMP4蛋白根据方阵试验结果(表3．4)，当POMP4的包被浓度为0．501．tg／mL、血清为400倍稀释时，阳性血清的OD450值在1．0左右，且阴性血清的OD450较低，P／N值最高。因此，选择抗原最佳包被浓度0．50}tg／mL，血清最佳稀释度为1：400。表3．2rPOMP2抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定Table3-2DeterminaitionofthecoatingconditionofrPOMP2andserumdillution表3．3rPOMP3抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定Table3-3DeterminaitionofthecoatingconditionofrPoMP3andserumdfllution38 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立表3．4rPOMP4抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定Table3-4DeterminaitionofthecoatingconditionofrPOMP3andserumdillution血清稀释度阳性血清阴性血清1OOx200x400x800xlOOx200x400x800x8．002．4242．0121．6850．9480．9570．5870．2560．162杭原4．002．4201．9481．4810．8240．9430．5730．2480．142旬祜2．002．3671．8561．3330．7360．8760．5570．3240．187池离1．001．9841．4821．1490．6310．8320．5510．2480．162，”：’二、0．501．5191．2321．0210．5050．5650．3600．1350．124L蚓1nL)0．251．3011．2850．9130．3480．475O．375O．1210．1123．2．2抗原包被条件的选择3．2．2．1重组POMPl蛋白由表3．5可以看出，POMPl以最佳浓度包被，在37℃包被2h的条件下，OD450的阳性值较高，阴性值较低，P／N值最高。因此，选取37"C包被2h作为POMPl最佳包被条件。3．2．2．2重组POMP2蛋白由表3-6可以看出，POMP2以最佳浓度包被，在4"C包被12h的条件下，OD450的阳性值较高，阴性值较低，P／N值最高。因此，选取4"C包被12h作为抗原最佳包被条件。3．2．2．3重组POMP3蛋白由表3．7可以看出，POMP3以最佳浓度包被，在4"C包被12h的条件下，OD450阳性值较高，阴性值较低，P／N值最高。因此，选取4℃包被12h作为抗原最佳包被条件。3．2．2．4重组PoMP4蛋白由表3．8可以看出，POMP4以最佳浓度包被，在37"C包被2h的条件下，OD450阳性值较高，阴性值较低，P／N值最高。因此，选取37"C包被2h作为抗原最佳包被条件。 华中农业大学2009届硕士学位论文表3．5rPOMPl抗原包被条件的确定Table3-5DeterminationoftheconditionforcoatingofrPOMPl表3-6rPOMP2抗原包被条件的确定Table3-6DeterminationoftheconditionforcoatingofrPOMP2 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立表3．7rPOMP3抗原包被条件的确定Table3-7DeterminationoftheconditionforcoatingofrPOMP3表3-8rPOMP4抗原包被条件的确定Table3-8DeterminationoftheconditionforcoatingofrPOMP4包被条件血清OD450平均值阳性1．7531．6541．6282．2431．82037℃1h阴性0．2380．1930．192O．2020．206P／N7．3668．578．47911．1048．821阳性1．8381．7971．7721．7131．78037℃2h阴性0．1970．1990．2030．2010．200P／N9．3309．0308．7298．5228．90337℃1h+阳性1．9471．9381．7991．8231．8774℃12h阴性0．2280．2610．2560．271O．254P肘8．5397．4257．0276．7277．43037℃2h+阳性1．8131．7361．6931．9121．7894℃12h阴性0．2230．2350．2580．2660．246P／N8．137．3876．5627．1887．285阳性2．0411．8441．7661．8341．8714℃12h阴性0．2240．2470．2380．240．237P／N9．1127．4667．427．6427．8873．2．3封闭液的选择由表3-9可以看出，这4种重组POMP90蛋白，用I％BSA封闭，阳性OD450值最高，P／N值最大，且阴性OD450值较低，因此选择I％BSA作为封闭液。41 华中农业大学2009届硕士学位论文表3-9封闭液的确定Table3-9Determinationofoptimalblockingsolution5％脱脂奶粉O．5％明胶I％BSA3．2．4二抗最佳稀释度的确定由表3．10可以看出，当POMPl．ELISA二抗以1：6000稀释、POMP2．ELISA二抗以1：5000稀释、POMP3-ELISA二抗以1：4000稀释、POMP4．ELISA二抗以1：5000倍稀释时，阳性血清OD450较大，阴性血清OD450较小，P／N值最大，因此确定其二抗最佳稀释倍数分别为l：6000、1：5000、1：4000和1：5000。3．2．5阳性临界值的确定根据统计学原理，样品的OD450值≥X+3SD值时，可以在99．99％的水平上判定为阳性。具体结果见表3．11，据此确定四种重组蛋白ELISA检测血清阳性的OD450临界值，POMPl为0．375，POMP2为0．350，POMP3为0．382，POMP4为0．425。表3．10二抗最佳稀释度的确定Table3-10DeterminationforoptimaldilutionofHRPrabbitanti-pigIgGantibody42 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立表3．11ELISA阳性临界值的确定Table3．11DeterminationofthresholdforELISA3．2．6特异性试验1)交叉试验具体结果见表3．12，结果表明，这四种疾病的阳性血清OD450值均低于阳性临界值，为阴性。表明四种ELISA方法均具有良好的特异性。2)阻断试验采用四种POMP蛋白建立的ELISA检测用重组抗原阻断后的阳性血清，结果表明阻断后OD450值明显低于未阻断的阳性血清，(N．P)／N值均大于O．5，进一步证明四种ELISA方法均具有良好的特异性。结果见表3．13。表3．12交叉试验结果Table3-12Theresultsofsera-crosstest43 华中农业大学2009届硕士学位论文3．2．7批内重复性试验采用四种蛋白ELISA对8份阳性血清进行检测，每份血清6个重复。检测结果表明，四种ELISA批内变异系数均小于10％，表明ELISA方法具有较好的重复性。结果见表3．14。表3．14重复性试验结果Table3-14TheresultsofduplicativitytestPOMPlELISAPOMP2ELISAPOM咿3ELISAPOMP4ELISA变异系数1．58％"--7．32％3．56％～6．73％3．12％～7．32％2．98％～7．61％3．2．8符合性试验用四种POMP．ELISA和IHA试验对180份猪血清样品进行检测，结果见表3．15。由表可以看出，四种ELISA检测结果与IHA均有较高的符合率，且POMPl．ELISA与IHA符合率最高。ELISA可对IHA检测的可疑样品判定阴阳性，表明ELISA方法具有比IHA更高的敏感性，且克服了IHA结果判断的主观性缺陷。 猪流产嗜性农原体病间接ELISA抗体检测方法的建立注：1)符合率(％)=(IHA+ELISA++mA—ELISA一)／(IHA++IHA一)×100％2)括号内为POMP3结果3．2．9POMP．ELISA检测方法的初步应用3．2．9．1部分省份猪场CAB感染血清学检测四个省份共18个猪场的猪群CAB血清抗体检测结果表明，除湖北省L场外，四个省份的猪场均有不同程度的CAB感染，CAB抗体阳性率由10．O％至83．3％不等，平均阳性率为30．7％，具体结果见表3．16。3⋯292不同年龄猪的CAB血清抗体检测结果将这968份血清按不同年龄可分为公猪、母猪及不同日龄的仔猪，通过对不同年龄猪的检测，结果显示成年猪尤其是母猪的CAB抗体阳性率比公猪高，仔猪的CAB阳性率最低，结果见表3．17。45 华中农业大学2009届硕士学位论文表3．16部分省份猪场CAB抗体监测结果Table3-16DetectionofantibodylevelsagainstswineCABinsomepigherdsfromdifferentdistricts表3—17不同年龄猪群的CAB抗体监测结果Table3-17DetectionofantibodylevelsagainstswineCABinthepigsfromdifferenrtages检测份数阳性数(份)阳性率(％)公猪662030．3母猪30112340．9仔猪60115425．8 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立3．3讨论pomp90基因具有很强的种特异性，在其他衣原体中未发现其同源序列，其蛋白能区分流产嗜性衣原体和其他类型衣原体的感染。Longbottomelal(2001；2002)利用POMP的多个不同小片段建立的ELISA抗体检测方法与补体结合试验相比较，具有更高的敏感性和特异性，且POMP90．3和POMP90．4片段在敏感性和特异性方面最佳，具有较强的应用价值，以其建立的反刍动物ELISA诊断试剂盒已经投入临床使用。本试验中设计的四种不pomp90基因既包括pomp90-3和pomp90-4，也包括包含pomp90-3、pomp90—4的两个大小在40kDa左右的大片段pomp90一J和pomp90-2，而pomp90—2比pomp90-1多出一段包括连续17个G的135bp的序列。以四种基因的重组表达蛋白做为检测抗原，经各项条件优化和确立临界值后建立的间接ELISA方法与IHA相比具有较高的符合率，特异性强，重复性好，且克服了mA灵敏度低、检测主观性强等缺点，因而适合进行猪流产嗜性衣原体的血清抗体检测。而且，本研究结果表明重组POMPl是建立ELISA诊断方法的一种良好候选抗原，在与IHA符合率方面甚至优于重组POMP4。POMPl编码基因是一段包含pomp3和pomp4基因的较长pomp90基因片段，其原核表达蛋白抗原表位可能更接近病原在动物机体内的表达蛋白，因此也更适合于作为CAB的抗体检测抗原。采用本试验建立的POMPl。ELISA方法对送检的来自湖北、河南、安徽、广东四个省份的968份血清抗体监测结果表明，18个猪场有17个猪场感染了猪流产嗜性衣原体病，猪场阳性率高达94．4％，这17个猪场中CAB抗体阳性率最高为83．3％，最低为10．0％，平均为30．7％，而这些猪场并未进行流产嗜性衣原体免疫，这表明猪场流产嗜性衣原体的感染比较普遍，有的猪场甚至很严重(高达83．3％)。同时，此次调查结果表明，不同年龄段的猪群的血清CAB抗体阳性率不同，种猪明显比仔猪要高，且母猪比公猪又要高，这表明CAB更易感染种猪。但是有的猪场发生难以治愈的流产，而有的猪场并未表现出流产，因此CAB感染在引起部分猪场发生流产中占主导地位，还是协同其它病原导致流产，有待于进一步深入研究。但对于种猪场中流产嗜性衣原体感染问题，还是应当给予一定的重视。47 华中农业大学2009届硕士学位论文结论(1)以流产嗜性衣原体CP／12株基因组为模板，应用PCR技术获得了四种不同大小的pomp90基因片段，并分别将其克隆到原核表达载体pGEX-KG，成功构建了重组质粒pKG．POMP1、pKG．POMP2、pKG—POMP3和pKG-POMP4。构建的四种重组质粒在E．coliBL21菌株中均可以高效融合表达，融合表达产物进行纯化后采用Western．blot检测均具有较好的反应活性。(2)以四种POMP90蛋白为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法，其中POMPl一ELISA最为灵敏和特异，并初步应用该方法对临床血清进行了检测。结果表明，该方法具有灵敏、特异、准确、重复性好等优点，克服了传统IHA低灵敏度、判断主观性强等缺点。 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华中农业大学2009届硕士学位论文硕士期间发表的相关文章：【1】吕晓娇，梅仕林，栗绍文，姚宝安．流产嗜性衣原体病诊断研究进展．黑龙江畜牧兽医，2008，ll【2]梅仕林，孟宪荣，栗绍文，何诚，杨琪，喻翠翠，张望，毕丁仁．猪流产嗜性衣原体POMP90蛋白的原核表达及反应原性分析．华中农业大学学报，2008，27(4)：491--494[3】梅仕林，孟宪荣，何诚，杨君敬，喻翠翠，张望，栗绍文，毕丁仁．猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法建立．扬州大学学报，2008S1，29(9)：79．83 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立致谢随着论文的完成，我的硕士阶段的学习即将结束。这三年的学习，让我受益终生。在平时的学习、工作和生活中，我得到了很多老师、同学、朋友的指导、关心和帮助，在此谨向他们致以我最诚挚的谢意!在科学探索中，导师求真务实、严于律己、刻苦勤奋的科研态度和工作作风给我留下了深刻的印象，在今后的工作中将继续给我以启迪和警示。在此我首先要向我的论文指导教师毕丁仁教授和栗绍文副教授致以我衷心的感谢和崇高的敬意。他们从论文的选题、方案设计及课题实施都给予了我悉心的指导，并为我的学习和工作创造了优越的条件，给予了我充分的施展空间。在此，要特别感谢栗绍文副教授，不管是在中国农大还是在华中农大学习期间，他都给予了我生活和工作上的关心和帮助，他的宽容，激励，敬业都给了我巨大的鼓舞和信心。在试验的设计、研究过程中，中国农业大学动物医学院何诚教授不仅提供了技术指导，而且提供了经费资助，保证了课题研究的顺利进行。实验室硕士杨琪、刘伟、张畅，硕士生张发明、李应超、杨君敬、袁吉磊、凌勇、李素梅等，在我的研究过程中，也给予了很大的指导和帮助，在此向他们表示衷心的感谢。感谢石德时副教授、肖运才副教授、胡思顺副教授、刘梅副教授、孟宪荣讲师、王喜亮讲师在实验过程中给予的支持和帮助，在此深表谢意!感谢本研究室博士后田文霞，博士生周祖涛、张进良、李东、郭延成、巴巴卡(babacar)，硕士生王玉珍、周蕾、卢林静、苏金玲、郭子晟、罗敏、罗俊、张文泽、张水平、任娟、李淑云、喻翠翠、张望、王瑞、覃平、崔卫涛、喻伟、沈亚安、熊媛媛、周晓芬在实验过程中给予的支持与帮助!感谢本室已毕业研究生彭伏虎、李建丽、李晓云、杜红霞、张道宏、郝卫芳、陈芬芬、郑娟、蔡良水、王政、吴玉石、张文通、张展英、商恒等给予的关怀和帮助，深表谢意!在三年的研究生生活中，我要感谢同窗好友吕伟、项文、秦占国、罗何峰、马青山、冯斌、涂加钢等以及06级研究生预防兽医学班的全体同学给我的热忱帮助!衷心感谢华中农业大学动物科技．动物医学院、研究生处和教务处等各级领导对我的关怀和培养!最后，我要特别感谢父母的养育之恩和妹妹、弟弟给予的鼓励和援助，他们的无私爱心和鼓励是我永远的动力源泉和精神支柱；正是他们的支持和帮助，我才能够在学习和工作上无后顾之忧，全身心的投入学习和研究工作中。谨向所有关心我的师长、亲友和朋友们表示深深的谢意!梅仕林二00九年六月于武汉55 猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立作者：梅仕林学位授予单位：华中农业大学被引用次数：4次参考文献(11条)1.何启盖,陈焕春,吴斌,汪超,吴美洲,邱昌庆,李树春,逯忠新猪衣原体病和布鲁氏菌病血清学调查[期刊论文]-中国兽医科技2000(03)2.罗建,杨小燕,戴爱玲,李晓华规模化猪场母猪衣原体病的血清流行病学调查[期刊论文]-福建畜牧兽医2006(05)3.苗振川,哈斯阿古拉,赵亚芳,张宝发,郭志成,张鹤龄用聚合酶链反应检测羊流产衣原体的初步研究[期刊论文]-中国兽医杂志1999(02)4.栗绍文猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究[学位论文]博士20085.邱昌庆,高双娣,周继章,程淑敏,帅永玉猪衣原体病的调查[期刊论文]-动物医学进展2003(02)6.邱昌庆,周继章,谷玉辉猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定[期刊论文]-中国兽医科技2002(06)7.邱昌庆衣原体分类研究进展[期刊论文]-中国兽医科技2000(12)8.谢琴,高跃路,何存利,史建斌,祁茹单克隆抗体在动物衣原体病血清诊断上的应用[期刊论文]-中国预防兽医学报2001(05)9.谢琴,何存利,史建斌,张明林,祁茹用单克隆抗体快速诊断衣原体病[期刊论文]-动物医学进展2001(04)10.杨琪猪流产嗜性衣原体Omp-1基因及其重组蛋白免疫应答的研究[学位论文]硕士200611.朱其太衣原体分类新进展[期刊论文]-中国兽医杂志2001(04)本文读者也读过(10条)1.汪圣强.糜祖煌鹦鹉热衣原体感染的分子诊断现状[期刊论文]-中国人兽共患病杂志2002,18(5)2.苗振川.哈斯阿古拉.赵亚芳.张宝发.张鹤龄.MiaoZhenchuan.HasiAgula.ZhaoYafang.ZHANGBaofa.ZhangHeling羊流产衣原体主要外膜蛋白基因的克隆与序列分析[期刊论文]-畜牧兽医学报2001,32(1)3.胡永杰.卜红霞.HUYong-jie.BUHong-xia垃圾邮件过滤技术研究[期刊论文]-河北师范大学学报（自然科学版）2006,30(2)4.栗绍文猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究[学位论文]20085.祝丙华人细小病毒B19VP2蛋白的优势表达与抗原活性检测[学位论文]20066.赵淑敏持有型犯罪归责原则之辨正[期刊论文]-法制与社会2011(16)7.刘长德.张艳.殷敏.郑永刚超高倍显微诊断仪在泌尿生殖道支原体衣原体快速检查中的临床应用[期刊论文]-中国实验诊断学2008,12(11)8.朱福全家畜衣原体病的临床症状及剖检变化[期刊论文]-养殖技术顾问2011(1)9.黄东辉.黄树杰.程文海.卢和琨.谢礼豪.谭仲楷男性泌尿生殖道沙眼衣原体感染的两种免疫检测方法的比较[期刊论文]-中国皮肤性病学杂志2001,15(4)10.刘向伟.端青.张浩杰.王效义.何君.张国珍鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因序列的扩增、克隆和原核表达[期刊论文]-微生物学免疫学进展2002,30(2)引证文献(4条)1.喻翠翠猪结合珠蛋白单克隆抗体的制备及初步应用[学位论文]硕士20102.张文通,魏凤,李峰,苗立中,沈志强猪流产嗜性衣原体病诊断方法研究进展[期刊论文]-中国猪业2014(07)
