检测牛血清新孢子虫和弓形虫抗体间接elisa的建立与应用

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1、摘要新孢子虫(Neosporacaninura，N．caninum)和弓形虫(Toxoplasmagondii,Zgondii)是两种顶复Rfl原虫，它们在形态学和生物学上有很多相似的地方，能感染多种哺乳动物，在世界范围内流行，给畜牧业造成严重经济损失，给人类健康带来潜在威胁．它们之间存在部分交叉抗原，在生产实践中常需要鉴别诊断．本研究利用重组蛋白分别建立了检测新孢子虫抗体和弓形虫抗体的间接ELISA方法，并对我国十个省(市)4个品种牛群的感染情况进行了血清流行病学调查，为我国牛群新孢子虫和弓形虫感染的流行病学监测、诊断提供有效手段．原

2、核表达的新孢子虫NcSRS2和NcSRS2一SAGI蛋白经O．5mmol／LIPTG诱导后4-6小时，重组蛋白表达量最高．Western-Blotting分析表明，重组蛋白可被新孢子虫阳性血清所识别．分别用纯化的新孢子虫重组蛋白NcSRS2和NcSRS2．SAGI作为抗原，建立了检测新孢子虫抗体的间接ELISA，并确定了间接ELISA的最佳工作条件。其中NcSRS2重组蛋白抗原的最适包被浓度为61目g／mL；最佳条件为4℃过夜包被；待检血清的最适稀释度为l：50；HRP-羊抗牛IgG的最适工作浓度为l：8000：封闭条件为5％马血清37

3、℃作用30rain；血清样本的阴阳性临界值为0．2。与间接免疫荧光试验和商品化ELISA检测试剂盒相比较，NcSRS2蛋白具有较好的特异性和敏感性，更适于血清流行病学的调查。用NcSRS2间接ELISA对我国牛群进行新孢子虫血清流行病学调查，结果表明，各地奶牛新孢子虫抗体阳性率在3．6-52．7％之间，平均抗体阳性率为27．7％。统计数据显示：新孢子虫抗体阳性牛的流产几率要高于抗体阴性牛，且由新孢子虫引起的流产主要发生在妊娠中后期；新孢予虫抗体阳性与牛的年龄和产胎次数没有明显关系；我国奶牛场已普遍存在新孢子虫感染。牦牛血清中也检测到新孢

4、子虫抗体，抗体阳性率为2．22％，水牛和肉牛未检测到新孢子虫抗体。从弓形虫基因组DNA中克隆得到SAGl和GRA6基因片段，利用分子生物学软件选出抗原性最强的部分，构建pGEX-GRA6-SAGl重组质粒，在原核表达系统中表达。重组蛋白GRA6-SAGI经0．5mmol／LIPTG诱导后6小时，表达量最高，占菌体总蛋白的25％，分子量约为57KDa。经Westem-Blotting检测，能被弓形虫阳性血清所识别。以纯化的弓形虫重组蛋白GRA6-SAGI作为抗原，建立了检测弓形虫抗体的间接ELlSA，并确定了重组蛋白抗原的最适包被浓度为1

5、01ig／mL；最佳条件为37"C作用2h后4"C包被过夜；待检血清的最适稀释度为1：25；HRP-羊抗牛lgG的最适工作浓度为1：4000；封闭条件为10％马血清3T'C作用1．5h：血清样本的阴阳性临界值为O．2。阻断试验，交叉反应试验、重复性试验以及与IliA比较试验表明，该方法具有较好的特异性和敏感性。牛弓形虫病血清流行病学调查结果表明，我国奶牛中存在弓形虫感染，阳性率为2．O％。水牛和肉牛的样本较少，没有检测到弓形虫抗体。青海地区牦牛的弓形虫感染率较高，血清抗体阳性率达11．8％。关键词：新孢子虫，弓形虫，原核表达，间接ELI

6、SA，血清学调查AbstractNeosporacaninumandToxoplasmagondiiaretwoApicomplexaprotozoans．Theyhavemorphologicandbiologicsimilaritiesandcausethediseasesofreproductivesysteminmammalian．BothoftbemaredistributedworldwideandbovineabortionsduetoⅣeaninumandZgondiiinfectionhadbeenreported,a

7、ndresultsineconomiclossorthreatensforhumanhealth．Theyalwaysneeddifferentialdiagnosisbecauseofsomecross-reactingantigens．ThisstudyestablishedtheindirectELISAtodetectedantibodyagainstNeosporaeaninumorToxoplasmagondiiusingthepurifiedrecombinantproteins．Wedidtheseroepidemiol

8、ogicstudiesoffourvarietalearleintenprovincesofChinabyestablishedELISA．Thestudyprovidedanavailabletechni