济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离鉴定与vp1蛋白的原核表达

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1、济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离鉴定与VPl蛋白的原核表达济南市手足口病患者肠道病毒7l型的分离鉴定与VPl蛋白的原核表达专业：病原生物学研究生：赵元昊导师：孟红研究员中文摘要目的：1．从2008年7月至2009年3月济南市手足口病患者的临床粪便标本中分离得到病原体并对其进行鉴定。2．对所分离到的EV71分离株的5’UTR区基因序列，VP4蛋白基因编码序列和VPI蛋白基因编码序列进行序列测定，对所获得的核酸序列所进行比对，分析其基因特征并进行基因分型。3．为了提供疫苗研究和免疫学检测试剂的研发基础，对EV71的VPI进行原核表达并对其进行初步鉴定a『方法：1．EV71的分离和鉴定：

2、标本的采集和处理均按照中国疾控中心的《手足口病标本采集及检测技术方案》进行操作，使用三种细胞系},lAl04、Vero和RD对标本中的病毒进行分离。分离获得的病毒毒株使用RT-PCR法进行分子生物学鉴定，鉴定时使用肠道病毒通用引物、肠道病毒7l型特异性引物和柯萨奇病毒A16型特异性引物进行鉴定。2．EV71的基因分型和基因特征分析：使用引物EVPIS和EVPIA对VPl编码基因进行RT-PCR扩增，使用引物EVGIS和EVGIA对5’UTR区和VP4编码基因进行RT—PCR扩增，将扩增后获得的DNA克隆至PMD-18T载体上后进行测序。所获得的基因序列使用Bioedit和MEGA4软件进

3、行分析并构建进化树。3．重组EVTlVPl蛋白的原核表达：使用引物EVPLA和EVPLS对VPI编码基因进行扩增并构建重组载体PET-30a-VPI，将其转化大肠杆菌Transetta后获得工程菌。使用IPTG对工程菌进行诱导获取基因工程蛋白，使用Western-Blot法山东省医学科学院硕士学位论文和抗His标签单克隆对工程蛋白进行初步鉴定。结果：1．EV71的分离与鉴定：共从13例粪便标本中使用细胞分离共获得了7株病毒，经RT-PCR鉴定后，其中6株为肠道病毒71型，1株为柯萨奇病毒A16型。2．EV71的基因分型和核酸序列分析：获得了6株EV71分离株的VPl编码基因序列和2株EV

4、71分离株的5’UTR及VP4编码基因序列，序列分析结果表明所分离得到的6株病毒与中国大陆流行的大部分EV71病毒相对应的核酸序列具有极高的同源性，在进化树上，与大部分中国大陆地区的EV71分离株均位于同一大的分支上，属于C4亚型，但与早期的EV71C4亚型分离株位于不同的小进化分支上。3．重组EV71VPl蛋白的原核表达：经IPTG诱导后，在含有重组载体的大肠杆菌中表达了工程蛋白，。并使用抗6XHis抗体对该蛋白进行了鉴定，鉴定结果呈阳性。结论：1．在2008年7月至2009年3月期间流行手足口病流行期间肠道病毒71型为主要病原体，但并非唯一病原体，在此期间，流行的EV71主要为C4亚

5、型，‘但已经与早期中国大陆地区分离的C4亚型分离株有了一定的分化。2．重组EV71VPl蛋白在大肠杆菌Transetta获得了成功表达。关键词：肠道病毒71型；基因分型；原核表达2济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离鉴定与VPl蛋白的原核表达T1·●'●'．●^●·●·●一一^lSO上atlOnand1dentl士1CatlOnenterOVlrUS，上士rOmsamplesofHFMDpatientsofJinanCityandtheProkaryoticExpressionfVPlproteinlCExpressionorMajor．,PathogenicBiologyGradua

6、teStudent：ZhaoYuanHaoAdvisor．-MengHongResearcherAbstractObIjectivez1．Isolatedandidentifiedenterovirus71：Isolatedthepathogenfromstoolsamplesofhand，foot，andmouthdiseasepatientswhowereinfectedduringtheperiodfromJuly2008toMarch2009inJinan，andidentifiedthepathogen．2．Genotypingandsequencesanalyzationof

7、enterovirus71：Sequencingthe5’UTR，vplgeneand印聋geneoftheisolatedenterovirus71’Sgenome，thenanalysethesequencesandgenotypedtheisolatedvirus．3．ExpresstherecombinantvPlproteinofenterovirus71-Expresstherecombinant、，P1proteino