人参classiii几丁质酶gchi1基因克隆和原核表达研究

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1、人参classIII几丁质酶Gchil基因克隆和原核表达研究摘要：几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积，激发寄主植物的抗病反应，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆，构建原核表达载体pET-28a（+）-Gchil,利用IPTG诱导表达，经PAGE分析表明，该基因表达的蛋白分子量为34kD左右，其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑菌圈试验发现，IPTG浓度为0.6mmol/L时抑菌效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物

2、品种，提高作物抗病性具有重要参考价值。关键词：人参；几丁质酶；基因；分析中图分类号：S567.51文献标识码：A1前言几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有诱导作用，可激发寄主植物的抗病反应［1］。植物几丁质酶具有广泛的生理活性［2］,尤其在植物抗病方面具有重要作用［3］。研究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶基因的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。如几丁质酶参与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共生作用

3、：几丁质酶可以降解固氮菌的结瘤因子，Minic等研究苜蓿中的几丁质酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几丁质酶通过控制结瘤因子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡，而不产生过量的根瘤。此外，几丁质酶对结瘤因子的降解具有专化性，可能是决定根瘤菌的寄主专化性的因素之一［5］。本研究旨在通过构建几丁质酶表达载体制备几丁质酶，用于抗真菌等方面的相关研究。2材料与方法2.1实验材料人参由吉林农业大学基因工程实验室培育。大肠杆菌菌株为DH5-a,原核表达载体pET-28a(+)、BL21均是由吉林农业大学生命科学学院基因工程实验室保存。质粒小提试剂盒、ExTaq酶、solutionl连接酶、限制性内切酶、分子量

4、标准DL-2,000购自大连宝生物公司。异丙基-B-D-硫代半乳糖昔(IPTG)等均购自北京鼎国生物公司。植物基因组DNA小量提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒及清洁试剂为美国Axygene公司产品。引物和测序均由上海生工公司完成。2.2实验方法2.2.1人参Gchil基因扩增按GenBank中人参Gchil基因序列(GenelD：DQ532359)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点设计特异引物，并在引物两端分别加酶切位点。上游引物序列为5'CAATTAggATCCATggCATCTCATTTgTCg3含有XhoI酶切位点(下划线)。下游引物序列为5’CTATATCTCgAgTCA

5、CACATCgCTCTTgAT3?含有BamHI酶切位点(下划线)。采用上述引物进行PCR扩增反应，以人参cDNA为模板，反应程序如下：94£预变性8分钟；9/C变性30秒，62£退火30秒，72。(2延伸30秒，35个循环；反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.2人参Gchil基因原核表达载体的构建将纯化后的PCR产物用Xhol及BamHI进行双酶切，同时对pET-28a(+)质粒进行双酶切，然后进行去磷酸化处理,构建重组载体pET-28a(+)-Gchilo将此重组载体转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行PCR及酶切鉴定，将鉴定后质粒送至上海生工公司完成测序鉴定。2.2.3目的蛋

6、白的诱导表达及检测将含有表达载体pET-28a(+)-Gchil的大肠杆菌振荡培养至0D600=0.6时，加入终浓度分别为0.4、0.6、0.8和1.0mM/L的IPTG。30°C,200rpm/min振荡培养，诱导表达5h后，离心收集菌体，菌体以含0.2mg/ml溶菌酶和10mMDTT的磷酸钠缓冲液(20mM,pH7.2)悬浮，反复冻融4次,以超声波破碎后的样品离心，收集上清液进行PAGE检测。2.2.4目的蛋白活性鉴定目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定，将锈腐菌接种到PDA培养基，使其在251下生长1周左右。用直径lcm沾有上清液的滤纸放到菌丝边缘，以沾有无菌水的滤纸为对照，一周之后观察

7、生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大小确定菌株是否诱导表达几丁质酶，以及所产几丁质酶的活性。3结果3.1人参Gchil基因扩增及重组表达载体pET-28a(+)Gchil的鉴定经PCR扩增的Gchil基因片段经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果图1A显示能够扩增出897bp大小的特异核酸片段与预期相符。将构建的重组载体进行酶切鉴定后，能够获得约897bp的大小的条带与预期结果相一致，结果见图1B