人参CLASSⅢ几丁质酶基因克隆、序列分析及原核表达

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1、吉林农业大学硕士学位论文人参CLASSⅢ几丁质酶基因克隆、序列分析及原核表达姓名：孙炳欣申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李玉;李海燕20060501吉林农业大学硕士学位论文人参cLAssITI几丁质酶基固克隆、序列分析及原植表达人参CLAsSIII几丁质酶基因的克隆、序列分析及原核表达摘要几丁质(8一1．4．乙酰葡萄糖胺线形同聚物)是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有诱导物作用，可激发寄主

2、植物的抗病反应。植物几丁质酶具有广泛的生理活性，尤其在植物抗病性方面具有重要作用，植物几丁质酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一一。本文以人参为材料，首次从中克隆了ClassIII几丁质酶基因，并进行了序列分析，研究了该基因在大肠杆菌中的表达情况，其主要结果如下：1．通过RT—PCR与反向PCR方法，从人参中克隆到一个ClassIII几丁质酶基因，并进行测序，全长为1432bp，其中包含完整的开放阅读框即从第272位的起始密码子到第1169位的终止密码子，推测编码蛋白的氨基酸序列含298个氨基酸残基，无内含子，并在GenBa

3、nk上注册(D0532359)；2人参ClassⅡI几丁质酶基因与其它植物classIII几丁质酶基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性；通过对人参CIassIII几丁质酶基因的系统发育树分析得出，人参ClassIII几丁质酶和其它植物的C1assIII几丁质酶具有共同的起源；ClassI、ClassII和classⅣ几丁质酶来源于同一祖先，而classIII与classV几了‘质酶来源于同一祖先。3．人参ClassIII几丁质酶基因编码一酸性几丁质酶，等电点pI为4．55，预测分子量为31．4KD；人参classIII几丁质酶氨基

4、酸序列含有两个功能区域即N_端信号肽区和糖基水解酶18家族催化区；人参ClassIII几丁质酶蛋白的催化区内，144—152为几丁质酶18家族的活性位点，序列为LDGⅥ)H)Ⅲ，活性中心为E(GIu)；人参ClassIⅡ几丁质酶蛋白的成熟位点在第25—26的Ala—G1v之问；4用同源建模法模拟出人参CIassIⅡ几丁质酶的空间结构模型；5将人参ClassIlI几丁质酶基因亚克隆到大肠杆菌的表达载体pET．28a(+)中，并转入大肠杆菌BL21中，SDS．PAGE分析初步表明几丁质酶以包涵体的形式表达。关键词：人参，几丁质酶基因，序

5、列分析，原核表达童堡查些查兰堕主兰竺笙壅△查!些!!旦些工堕壁茎里塞堡：壁!!坌燮塑：查竺一Cloning，SequenceAnalysisandProkal了oticExpressionofCLASSⅢChitinaseGeneFrom，k以nx砌韶略AbstractChitin(alinearpolysaccharideofB—l，4—1inkedN-acetylgucosalnineresidues)isamajorconstituelltofpathogcnicfungalcdlwau．Chitinasedes仃oysdle

6、syl汕esisofchidn0nt11etopoffungalmycelium，des咖ctsdeposm彻ofnewma妇jalincenandtllenleadspamogenydcad．Andtlledebrisofcellwallcanstinlulateant卜diseaserespondOfhostasanmductorPlantchibnasesexhibitphysiologicactivitiesinmanywaysandpanicularb，playsaimportantroleinthediseasercsi

7、stanceofp1孤tPlaIltchitinaseis0neofhotpojntsinpIalltgeneticengineersoffungalresist卸ce．Inthisthcsis，aClassⅡIchi6nasegeIle0fAm删g巩se耀啪sflrstcoloncd，sequencedandaHaly捌．BKprcssionofchidnasegenehasbeenstudiedlAnovelCIassⅡIchmnasegelleofR掰甜∥聊怄wasdonedbyRT-PCRa芏ldInVersePCR．Th。

8、full-lengthgenomicsequenceof1432bp0fthcClassⅡIchi缸nascgenewassequcnced．Allenthopenreadingfr诅me(ORF)of298a11inoacidswa