geminin基因过表达对vsmcs表型转化影响及其分子机制探讨

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1、第三军医大学硕士学位论文Geminin基因过表达对VSMCs表型转化的影响及其分子机制探讨摘要一、研究背景在动脉粥样硬化、高血压以及血管成形术后再狭窄等增生性血管疾病的发生发展过程中，血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecells，VSMCs)的表型转化在这些疾病中发挥着非常重要的作用。VSMCs由分化表型向去分化表型的转化引起VSMCs的增殖和迁移，使处于静止状态的细胞，重新获得增殖能力，引发一系列的血管病变。VSMCs通常有两种不同的表型状态：分化表型和去分化表型，两者在一定条件下可以发生相互转化。不同表型状态的VSMCs有其标志性的

2、表型标志物，分化表型的主要表型标志物为a—actin，去分化表型的主要表型标志物为OPN。Geminin是细胞周期起始特许阻遏子，它通过整合细胞周期和细胞分化，在细胞的增殖．分化过程中起到了“开关’’作用。它既可以使细胞稳定在分化表型、又可以阻抑去分化表型细胞的DNA再次复制，以确保细胞基因信息遗传的稳定性。我们的前期研究显示，Geminin参与了VSMCs的表型转化，在不同表型状态的VSMCs中均有表达，但在分化表型中的表达较去分化表型中多。有研究显示，Geminin基因经siRNA干扰处理后，可以使细胞增殖能力增强，甚至过度增殖。Geminin是如何引起

3、表型转化的，其具体机制如何，目前还不甚清楚。在VSMCs发生表型转化的过程中，肌动蛋白发生相应的聚合和解离，这些是影响VSMCs处于不同表型的关键环节，肌动蛋白相关蛋白(actinrelatedprotein1,ARPl)在影响肌动蛋白聚合和解离的过程中也发挥着十分重要的作用。在VSMCs由分化表型向去分化表型转化的过程中，VSMCs获得增殖能力是前提；同时Geminin参与了VSMCs的表型转化。结合前期实验及目前的研究进展，我们推测：Geminin基因过表达可以促进VSMCs由去分化表型向分化表型转化，ARPl可能参与了上述Geminin影响VSMCs的

4、表型转化过程。二、研究目的通过对不同表型VSMCs进行Geminin基因过表达处理，了解Geminin如何影响VSMCs的表型转化，为探索增生性血管疾病的防治提供新思路。三、研究方法第三军医大学硕士学位论文1、不同表型VSMCs的培养VSMCs株(A10)被培养。采用10％FBSDMEM高糖培养基培养24h获得去分化表型VSMCs，无血清DMEM高糖培养基培养24h获得分化表型VSMCs。实验设置阳性组、阴性对照组和空白对照组∽=3)。2、pEGFP—N1一Geminin真核表达载体的构建及转染从VSMCs中提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增Gemini

5、n基因。pEGFP—N1质粒、Geminin片段均选用HindlII、saclI双酶切后进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5Q后利用质粒抽提试剂盒抽提质粒，采用双酶切和基因测序进行鉴定。构建的载体利用脂质体2000介导转染不同表型的VSMCs，通过荧光显微镜和Westernblotting半定量的方法检测转染效果。3、检测VSMCs中主要表型标志物的变化采用WesternNotting半定量的方法，选择GAPDH和13一actin作为内参，检测不同表型VSMCs经pEGFP—N1一Geminin过表达处理后，主要表型标志物(a—actin、OPN)的表

6、达变化情况。4、检测ARPl的表达变化及Geminin和ARPl之间的相互作用采用Westernblotting半定量的方法，选择GAPDH作为内参，检测VSMCs经pEGFP—N1一Geminin过表达处理后，ARPl的表达变化情况。并通过免疫共沉淀技术检测Geminin和ARPl两者问是否存在相互作用。四、研究结果1、成功获取具有代表性的不同表型的VSMCs。2、通过酶切反应和基因测序鉴定，证实目的基因Geminin成功插入真核表达载体pEGFP—N1。利用脂质体2000介导转染法，转染效率可以达到60％，Westernblotting半定量分析进一步证

7、实Geminin在阳性组中的表达明显高于阴性对照组和空白对照组，说明Geminin被成功过表达，满足后续实验的开展。3、分化表型A10细胞株中，阳性组、阴性对照组和空白对照组中0c—nctin比GAPDH的相对光密度平均值分别是(1．14+0．03)、(1．14+0．02)、(1．12±0．02)；去分化表型A10细胞株中分别是(1．14+0．03)、(0．84+0．03)、(O．82±0．02)，分化表型VSMCs中各组无明显差异，去分化表型VSMCs阳性组中a—actin表达上调，差异有统计学意义(P

8、和空白对照组OPN比B—actin的相对光密度平均值