c-kit、scf、cx43在先天性巨结肠中的表达及其相关研究

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1、温州医学院硕士学位论文C--kit、SCF、Cx43在先天性巨结肠中的表达及其相关研究姓名：夏丽娜申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：王宗敏；张海燕；赵志光2012-05温州医学院硕士学位论文C-klt、SCF、Cx43在先天性巨结肠中的表达及其相关研究中文摘要目的：通过检测先天性巨结肠肠壁中Cajal间质细胞、干细胞因子(SCF)、缝隙连接蛋白(Cx43)的表达和分布，以及先天性巨结肠中原癌基因C-kit在DNA、RNA和蛋白质三个水平的改变，探讨Cajal间质细胞、SCF及Cx43在先天性巨结肠发病机制中的作用。材料与

2、方法：收集68例温州医学院附属育英儿童医院2007年1月至2011年7月先天性巨结肠患儿手术切除标本的存档蜡块，根据HE染色结果，将神经节细胞正常的扩张段标本设为扩张组，无神经节细胞的狭窄段标本设为狭窄组。并收集8例我院近年尸检新生儿无消化道畸形结肠组织作为对照。所有标本均经10％中性福尔马林固定，常规包埋切片染色，镜下观察病理形态学改变，同时用免疫组织化学EliVision法检测C—kit、SCF及Cx43蛋白的表达，原位杂交检测C-kitmRNA的表达，FFPETPCR提取C-kitDNA进行基因测序。另选取先天性巨结肠标本2例，尸检

3、新生儿结肠标本2例，采用醋酸铀染色，JEM-2000EX透射电子显微镜观察。结果：1组织学观察对照组结肠和HD扩张组肠壁粘膜下神经丛和肌间神经丛内神经节细胞清晰可见，平均每个高倍镜视野可见4-6个神经丛，每个神经丛约3．5个神经节细胞，神经纤维未见增粗；狭窄组肠壁粘膜下神经丛和肌间神经丛内未见神经节细胞或偶见变性的神经节细胞，神经纤维明显增生，排列紊乱。2C．1(it蛋白、C-kI'tmRNA、C．kit基因检测结果2．1．免疫组化2．1．1对照组和皿扩张组肠壁可见大量C-kit阳性细胞即ICC，平均每个高倍视野细胞数分别为39．384-

4、4．65和36．064-4．44，与平滑肌细胞紧贴并与其平行走行，彼此间通过胞质突起相互连接形成网络。HD扩张组肠壁各层ICC的数目与正常对照组无显著性差异(P>0．05)。2．1．2HD狭窄组，肠壁各层C-kit阳性细胞ICC明显减少甚至消失，平均每个高倍视野细胞数4．624-1．72。肌间神经丛周围、粘膜下层以及环肌层内ICC数目显著减少甚至消失，正常ICC网络结构消失，纵肌层ICC几乎完全消失，HD温州医学院硕士学位论文狭窄组肠壁各层内ICC的数目与正常对照组相比，有显著性差异(P<0．05)。2．2C—kitmRNA的表达原位杂交

5、C-kitmRNA的阳性表达位于胞浆，与免疫组化C—kit蛋白的表达基本一致。对照组和HD扩张组肠壁平均每个高倍视野C—kitmRNA阳性细胞数分别为35．50+_4．54，32．46±4．28，HD扩张组C-kitmRNA的表达与正常对照组无显著性差异(P>0．05)；狭窄组肠壁平均每个高倍视野C-kitmRNA阳性细胞数为4．664-1．28，与正常对照组比较有显著性差异(P<0．05)。2．3C-kit基因检测经过基因测序未发现有意义的C-kit基因序列突变病例。3SCF蛋白检测结果利用IPP6．0软件计算显色反应的平均吸光密度值来

6、表示其阳性程度。HD扩张段肠壁肌层SCF表达呈弥漫阳性，其0D值与正常对照组比较无显著性差异(P>0．05)；HI)狭窄组肠壁肌层SCF表达阴性，其oD值与正常对照组比较有显著性差异(P<0．05)。4缝隙连接蛋白免疫组化检测结果：对照组和HD扩张组肠壁缝隙连接蛋白Cx43表达阳性，阳性细胞主要位于神经丛，平均每个高倍视野阳性细胞数分别为26．93±3．42，27．504-3．16，肌间也有散在分布，粘膜下层和纵肌层未见或少见Cx43的表达，HD扩张组阳性细胞数与正常对照组比较无显著性差异(P>0．05)；liD狭窄组肠壁肌层内Cx43表

7、达显著减少，各层中偶见Cx43的表达，平均每个高倍视野阳性细胞数为8．404-1．66，与正常对照组比较有显著性差异(P<0．05)。5透射电子显微镜观察对照组及皿扩张组肠壁可见ICC在电镜下具有巨大卵圆形核，核周胞浆少，胞浆突起呈纺锤状，有发育良好的粗面内质网，丰富的线粒体，高尔基复合体。ICC之间，与神经细胞及平滑肌细胞之间均存在“缝隙连接”。皿狭窄组ICC孤立存在，突起消失，与周围细胞之间无连接，但其内部结构如线粒体等细胞器等未发现明显变化；ICC之间及平滑肌细胞之间缝隙增宽，缝隙连接较为稀疏甚至消失。结论1．先天性巨结肠主要病理学

8、改变为狭窄段肠壁神经丛减少，神经节细胞缺失，神经纤维增粗、排列紊乱；此外还发现ICC减少或消失、网络结构破坏、ICC之间与平滑肌细胞之间缝隙连接结构破坏，是先天性巨结肠的病变基础；2．C-ki