creb信号通路调控宫内炎症后仔鼠海马神经发生及分子机制研究

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1、浙江大学博士学位论文CREB信号通路调控宫内炎症后仔鼠海马神经发生及分子机制研究姓名：江佩芳申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：俞惠民20120530浙江大学博士学位论文中文摘要CREB信号通路调控宫内炎症后仔鼠海马神经发生及分子机制研究浙江大学医学院博士研究生导师中文摘要儿科学江佩芳俞惠民教授围产期胎儿炎症反应综合征(FetalInflammatoryResponseSyndrome，FIRS)是造成早产和早产儿脑白质损伤的最常见原因，临床与流行病学资料证实早产儿脑白质损伤是儿童脑瘫的一个重要危险因素。由于早产儿脑自质损伤将影响神经系统发育，所以脑损伤后神经再生修复机制的研究将显得尤为

2、重要。cAMP反应序列结合蛋白(CREB)是一种重要的核转录因子，调节启动子中具有环磷酸腺苷反应单元(CRE)的基因转录，在神经元再生、突触形成及学习记忆等方面具有重要的调节作用，是细胞内多种信号通路的一种关键成分．虽然国内外研究发现，缺氧缺血能诱导海马神经发生，但是对宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生的研究目前很少涉及，而且CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生和认知损害修复的分子机制尚不明确．本研究通过建立宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型，研究仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律；以及研究CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生；而且通过P13K抑制剂LY294002和P

3、DE4抑制剂Rolipram干预，探讨CREB信号通路在宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制．从脑损伤自身修复角度进一步阐述CREB信号通路在神经发生及认知功能改善中的作用和分子机制，为防治早产儿脑白质损伤和儿童脑瘫的康复提供理论依据．II浙江大学博士学位论文中文摘要目的：研究宫内炎症脑白质损伤后仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律，明确CREB信号通路是否参与调节脑白质损伤后海马神经发生，解释CREB信号通路在宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制，阐明CREB信号通路在官内炎症脑白质损伤后海马神经发生及认知功能改善中的重要意义．方法：1．动物模型：实验动物分

4、2组：①空白对照组：在各时间点和实验组等数量配对，②宫内炎症组：SD雌鼠孕15天于左右两侧宫颈内各注射大肠杆菌稀释液0．2mL，待其生产，制备宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型．各组仔鼠在不同时间点腹腔注射Brdu，24h后行主动脉灌注固定后制备3、7、14，28日龄脑组缌石蜡标本，用免疫组织化学法检测BrdU阳性的增殖细胞数目变化；7日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU／Nestin)检测海马齿状回神经干细胞增殖情况；28日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU／NeuN、BrdU／GFAP)检测海马齿状回神经元与星形胶质细胞分化情况。2．Morris水迷宫法：水迷宫的水池直径为100cm，高6

5、0era，水深51cm，水温(22-士0．5)oC，站台高度为50era，站台顶端平面10cmxlocm，平台没于水面下lcm，水池周围参照物保持不变．实验包括：①适应性训练：实验前1d让动物在无安全平台的水中适应性游泳2rain；②定位航行试验：实验历时5d，每日分上、下午系列，每个系列包括4次，操作者将大鼠面向池壁从不同象限入水，发现平台后，让其在平台上站立30s，将大鼠从平台上拿下来休息60s，再随机由下一象限入水进行试验，如果120s内找不到平台，则由操作者帮助其上平台，潜伏期记为最高分120s．记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)；③空间探索试验：第6天，撤去平台，取随机一点投大鼠

6、入水池中，记录2min内大鼠穿过平台所在象限的时间。④探索实验结束后，休息三天，即水迷宫的第10天，再对全部大鼠进行一次水迷宫测试，方法同定位航行试验，测试其远期记忆的保持能力．3．CREB信号通路与神经发生：宫内炎症组和空白对照组动物在相应时间点III浙江大学博士学位论文中文摘要(3、7、14、21、28日龄)断头取脑，应用RT-PCR及Westernblot检测海马齿状回P．Akt、Survivin、P．CREB、BDNF、TrkBmRNA和蛋白质表达变化；应用免疫组化在28日龄对p-Akt、P．CREB、BDNF进行定位染色，进一步明确CREB信号通路的主要基因p-Akt、p-CREB

7、和BDNF在海马齿状回神经细胞的表达情况．通过以上方法证明CREB信号通路参与宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生．4．CREB信号通路干预：宫内炎症组和空白对照组动物侧脑室微量注射P13K阻滞剂LY294002阻断P13K／Akt信号通路，同时应用磷酸二酯酶(PDE4)抑制剂Rolipram，增加脑内cAMP浓度从而激活CREB信号通路．两组动物分别在28日龄进行Moms水迷宫实验观测仔鼠学习记忆能力改变，并通