菲律宾蛤仔(venerupis philippinarum)在苯并(a)芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究

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1、中国海洋大学博士学位论文菲律宾蛤仔（Venerupisphilippinarum）在苯并（a）芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究姓名：刘娜申请学位级别：博士专业：水产养殖指导教师：潘鲁青201206菲律宾蛤仔(坛”gr印括philippinal,'bl聊)在苯并(a)芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究摘要本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状，以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔(阮nerupis口hilippinarum)为研究对象，克隆了菲律宾蛤仔芳烃受体介导的解毒代谢途径几种关键基因，包括芳烃受体蛋白(AhR)、芳烃受体核转位因子(ARN

2、T)、热休克蛋白90(HSP90)。研究了毒性强的多环芳烃(PAlls)——最苯并(a)芘(BaP)对菲律宾蛤仔组织解毒代谢相关基因的表达调控规律，通过对在BaP胁迫下菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因的克隆及基因表达分析，探究双壳贝类PAHs解毒代谢机制；构建了菲律宾蛤仔PAHs消减eDNA文库，筛选、鉴定了差异表达基因，结合室内实验和海区现场验证，初步建立了基于菲律宾蛤仔的PAHs分子生物标志物监测技术，为海洋环境污染监测和水产品安全评价提供基础数据和技术支持。1菲律宾蛤仔芳烃受体(AhR)介导的关键基因克隆与表达分析菲律宾蛤仔芳烃受体蛋白(VpAhR)的eDN

3、A全序列长28706p，开放阅读框(ORF)长为2391bp，共编码796个氨基酸残基，不具备信号肽，属于胞内蛋白，含有2个核定位序列(NLS)：K45RRRR49和P67SKRHRE73。BLAST分析表明VpAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性。VpAhR含有1个碱性螺旋．环．螺旋结构(bHLHdomain)和2个配体结合区(PASdomain)，属于bHLH．PAS转录因子家族。序列分析显示，VpAhR的配体结合区(a．a．220—383)与砂海螂(Marenaria)和斑马纹贻贝(D．polymorpha)AhR的配体结合区相似性很高。实时定量

4、PCR分析表明VpAhR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、外套膜和闭壳肌中均有表达，鳃组织中表达量最高。菲律宾蛤仔ARNT片段长485bp，编码161个氨基酸残基，该序列含一个由44个氨基酸构成的PAS结构域(a．a．7．50)，该区域与其他物种ARNT的PAS结构域相似性较高；VpARNT在菲律宾蛤仔消化盲囊中表达最高，在鳃、外套膜和闭壳肌中也均有分布。HSP90是分子伴侣家族的重要一员，菲律宾蛤仔的HSP90基因片段cDNA长687bp，编码299个氨基酸，具有HSP90家族保守信号区(GVVDSEDLPLNISRE)，i与其他物种HSP90氨基酸序列具有很高

5、相似性，与栉孔扇贝(C．farre尸j)和海湾扇贝(么·irradians)的相似性均为99％，菲律宾蛤仔HSP90在鳃组织中表达量最高；不同浓度BaP(O．01、0．2“叽)染毒处理3d、10d，菲律宾蛤仔鳃组织中AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的基因表达水平随染毒浓度增大和处理时间延长而逐渐升高；除10d时0．2rtg／L组CYP4基因表达被极显著(尸<0．01)上调外，其余处理组CYP4mI州A表达水平在染毒期间与对照组差异不显著(尸>0．05)。实验结果表明BaP与甜瓜介导的菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因AhR、ARNT、HSP90和OSTpi的

6、mRNA表达具有明显的剂量一效应关系，符合生物标志物筛选原则，适于进行进一步的分析和现场验证。2菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下cDNA消减文库的构建与分析利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了BaP胁迫下(1“叽)菲律宾蛤仔正、反向cDNA消减文库，分别获得194个和93个重组克隆，测序分析显示，正、反向文库分别得到168个和83个EST序列，经同源序列相似性比对，正向eDNA文库中有31种基因与已知功能基因具有较高同源性，12种为假定蛋白，2种为未知蛋白；反向文库中已知功能基因10种，假定蛋白4种。所有ESTs序列信息均已提交Genbank数据库，eDNA

7、消减文库编号为LIBEST027169。进一步序列比对、功能注释及分类显示，通过SSH筛选到的菲律宾蛤仔差异表达基因主要为药物代谢、杂环化合物代谢、细胞分解代谢、抗生素响应等代谢过程相关基因。．3菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证设置一系列BaP染毒浓度(O．25、1和4肛g／L)，利用实时定量PCR检测染毒处理10d时菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因、SSH．selected差异表达基因及几种其他功能基因的mRNA表达。结果显示，测定的28种基因中Defensin、Serineprotease、ThioesterDrotein、GSTC、M

8、n．SOD、ARNT等12种基因被BaP诱导表达上调