蟾毒灵抑制人肝癌细胞mhcc97h转移的实验研究

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1、第二军医大学博士学位论文蟾毒灵抑制人肝癌细胞MHCC97H转移的实验研究姓名：陈永安申请学位级别：博士专业：中西医结合临床指导教师：凌昌全201205蟾毒灵抑制人肝癌细胞MHCC97H转移的实验研究摘要研究背景肝细胞肝癌占原发性肝癌的85％．90％，在我国是一种常见的肿瘤类型，其发病和慢性乙型肝炎密切相关。尽管近年来在预防和治疗策略上取得了一定的进展，其死亡率仍然居高不下。由于比较高的手术后肝内及远处转移发生率，肝癌的预后还是比较差。因此，阐明肝癌侵袭及转移的具体分子机制，变得越来越重要。肝癌的转移是一个复杂的生物学过程，每一环节都有多种因

2、素的影响和调控，例如细胞外蛋白酶、细胞因子、血管生成因子、生长因子、细胞黏附分子等。其中，Cdc42是Rho家族蛋白，是Ras超家族中相对小分子质量G蛋白的成员之一，有GTP酶活性。研究证实Cdc42是细胞骨架肌动蛋白的重要调节因子，而肌动蛋白的运动是肿瘤细胞伪足形成及肿瘤转移的关键因素，Cdc42在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环，与GDP结合形式游离于胞质中，与GTP结合形式则作用于细胞内的效应因子，与肝癌的转移密切相关。蟾毒灵(bufalin)的分子式为C24H3404，相对分子质量为386．5，是从传统中药蟾酥中提取

3、的一种毒性配基之一，已有研究表明蟾毒灵是一种Na+．K+-ATP酶抑制剂，属于蟾酥二烯羟酸内酯单体之一，因其分子结构与洋地黄类似，也被归为强心类固醇类。文献报道其能够抑制拓扑异构酶II的活性，干扰细胞DNA复制，早期多数研究集中在诱导人类白血病分化和凋亡方面，近年来有研究表明蟾毒灵可以抑制子宫内膜异位细胞以及卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长。在本研究中，我们利用高转移潜能的肝癌细胞系，通过体外及体内实验，来探索蟾毒灵对肝癌转移的抑制作用和Cdc42蛋白之间的相关性。发现Cdc42是蟾毒灵作用的靶点之一，在肝癌细胞运动和转移中起关键作用，

4、蟾毒灵可能是通过下调Cdc42来抑制肝癌转移。研究目的本研究观察蟾毒灵对肝癌侵袭转移的影响，在此基础上进一步通过体外、体内实验明确其抗肝癌细胞侵袭转移的具体机制，明确蟾毒灵抑制侵袭转移作用和Cdc42信号通路之间的关系，为寻找有效的抗肝癌转移药物和治疗靶点提供实验依据。第二军医大学博士学位论丈研究方法(1)不同浓度蟾毒灵抑制肝癌细胞运动的效应以不同浓度(50—400nmol／L)的蟾毒灵干预MHCC97H细胞，采用划痕实验定性研究蟾毒灵对肝癌细胞迁移的影响；在此基础之上，利用Transwell小室，包被基质胶，体外模拟基底膜，进行侵袭和迁移

5、实验，定量观察蟾毒灵对肝癌细胞侵袭、迁移的影响。(2)蟾毒灵对肝癌转移相关信号通路及Cdc42蛋白的影响首先，观察不同肝癌细胞系中Cdc42的表达情况，westernblot检测蟾毒灵对Cdc42蛋白表达的影响，构建Cdc42siRNA，观察Cdc42基因RNA干扰后对肝癌细胞侵袭能力的影响；观察蟾毒灵对MAPK信号通路的影响，分别使用ERK、JNK、P38抑制剂后观察蟾毒灵对肝癌细胞侵袭转移的影响；westernblot检测蟾毒灵对P53基因表达及下游靶分子Bax、P27的影响：分别提取胞浆胞核蛋白，观察NF—KBp65蛋白入核的变化；w

6、esternblot检测蟾毒灵对COX．2蛋白表达的影响；ELISA方法检测MMPs家族MMP．2、MMP．3、MMP．9水平变化。(3)蟾毒灵体内抑制MHCC97H肝癌细胞转移的实验研究原位植入建立裸鼠人肝癌转移模型LCI．D20，蟾毒灵干预后(低剂量组：0．25mg·kg。1d～；高剂量组：O．5mg·k雪hd1)，通过评价原位瘤的体积、重量来评价蟾毒灵的抑瘤作用，通过对裸鼠体重的评价来研究蟾毒灵对裸鼠肝癌转移模型恶病质的影响：肝脏原位移植瘤块，常规石蜡包埋病理切片并用免疫组织化学法观察肝原位移植瘤中Cdc42蛋白的表达情况：肺脏标本经

7、10％中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片、HE染色，于不同平面切片20-30张，以观察肺转移情况。争士甲：口木(1)蟾毒灵抑制肝癌细胞运动实验研究划痕实验结果显示，蟾毒灵干预组划痕损伤区发生迁移的细胞数目少于空白对照组，提示蟾毒灵具有抑制MHCC97H细胞迁移的趋势，Transwell小室侵袭及迁移实验结果显示蟾毒灵干预组穿膜细胞数明显少于对照组，差异有统计学意义(P<0．05)，50nmol／L蟾毒灵即能有效抑制肝癌细胞侵袭和迁移。(2)蟾毒灵对Cdc42蛋白及肝癌转移相关信号通路的影响Westernblot结果显示Cdc42蛋白在MHCC

8、97H细胞中高表达，蟾毒灵蟾毒灵抑制人肝癌细胞MHCC97H转移的实验研究(200nmol／L)处理后2h内Cdc42蛋白表达明显下调，Cdc42siRNA干扰后，能够增强蟾毒灵