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1、蟾毒灵抑制血管生成作用的初步观察论文.freelL。鸡胚绒毛尿囊膜实验表明蟾毒灵可显著抑制血管生成的作用,并呈浓度依赖性。结论蟾毒灵具有明确的抑制血管内皮细胞增殖、抗血管生成的作用。【关键词】蟾毒灵;抗血管生成;血管内皮细胞;鸡胚绒毛尿囊膜Abstract：ObjectiveToobservetheanti-angiogenesisactivityofbufalinandfindthebestreasonableconcentrationforfurtherclinicaluse.MethodTheinhibitoryeffectofbufalinonECV304c
2、ellsindifferenttimesandconcentrationsethod,itsconcentration-effectandtime-effectrelationshipethodofchorioallantoicmembrane(CAM).ResultBufalinhadinhibitiongroedependence.TheIC50of24,48,.freelLrespectively.IntestofCAM,differentconcentrationsofbufalincouldinhibittheangiogenesisofCAM(P0.01
3、)embrane血管生成是恶性肿瘤生长、侵袭和转移过程中必不可少的环节,而抗血管生成作为一种新的抗肿瘤治疗手段日益受到重视。蟾蜍是我国传统的中药材,很早就有蟾蜍全虫或蟾酥内服及外用治疗癥瘕积聚、痰注、恶疮等类似肿瘤疾病的记载。蟾毒灵(Bufalin,二羟蟾毒二烯酸内脂)是从中药蟾酥中提取的一种毒性配基之一,现代研究显示,蟾毒灵在体外对人白血病、胃癌及肝癌细胞生长均有一定的抑制作用1-4,我们的前期研究也发现蟾毒灵是蟾蜍中体外抗肝癌药理活性最强的单体之一5。但有关蟾毒灵抗血管生成作用的研究却鲜有报道,本研究观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的影响,并观察了蟾毒灵
4、对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管形成的影响。现报道如下。1实验材料DMEM培养基、10%胎牛血清、1∶250胰蛋白酶等为美国Gibco公司产品,HEPES缓冲液为德国Merck公司产品,四甲基偶氮唑盐(MTT)、蟾毒灵为Sigma公司产品。人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞购自中国科学院海细胞生物研究所,白皮受精鸡蛋购自上海太平洋家禽有限公司。MIQAS医学图像定量分析软件由上海申腾信息技术有限公司提供。2实验方法2.1人脐静脉内皮细胞ECV304的培养细胞解冻后于含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,取指数生长期细胞用于实验
5、。2.2对体外培养ECV304细胞生长活性的影响ECV304细胞以5×104/孔接种,10%小牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2培养至融合状态,换成无血清培养液培养24h后,加入不同浓度蟾毒灵(分别为3.8×10-5、3.8×10-4、3.8×10-3、3.8×10-2、0.38、3.8?g/mL);阴性组为不加药物处理的细胞悬液;空白组为无细胞及药物的培养液。作用24、48、72h3个时间点采用MTT法检测细胞生长抑制率。抑制率(IR%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。并采用加权直线线性回归法求得细胞生长抑制率为50%时的药物浓度
6、。2.3对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用种蛋置于37℃培养箱中孵化第7日,消毒,开窗,制备假气室。放置无菌明胶海绵小块(4mm×4mm×4mm),分别滴加不同浓度的蟾毒灵(3.8×10-3、3.8×10-2、0.38?g/mL);对照组加同体积生理盐水。封闭窗口孵育72h后固定,剪下约3cm×3cm的尿囊膜拍摄并进行图像定量分析。3统计学方法所有数据采用SPSS11.5统计软件处理。选择方差分析进行方差齐性检验,多组均数间两两比较采用Student-Nean-Keuls法。P0.05提示差异有统计学意义。4结果4.1不同浓度蟾毒灵对ECV304细胞增殖的影响不同浓度的
7、蟾毒灵对ECV304细胞生长均有不同程度抑制作用(P0.05),实验中最低浓度(3.8×10-5?g/mL)抑制率即可达16.4%,且抑制作用随药物浓度递增而提高,同一时间各浓度间差异有统计学意义(P0.05),提示其作用具有浓度依赖性。4.2药物作用时间对ECV304细胞增殖的影响随着作用时间的延长,蟾毒灵抑制效果增强,作用呈现时间依赖性,同浓度不同时间差异显著。72h时低浓度(3.8×10-5?g/mL)抑制率即可达23.45%,而高浓度时(3.8?g/mL)抑制率达81.87%,显示出较强的抑制作用。24、48、72h的IC50分别为1.104、0.355
