利用敲除plcζ基因的jm8细胞制备嵌合体小鼠

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1、河北农业大学硕士学位论文利用敲除PLCζ基因的JM8细胞制备嵌合体小鼠姓名：王鹏博申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：李相运20120527摘要PLC是磷脂酰肌醇信号转导途径中非常重要的一个关键酶。而PLC己则是磷脂酶C最短的一个同工酶，是结构和功能独立的新型PLC。通过研究发现PLC‘构型中催化区的链接点对受精的作用至关重要。PLC‘的发现可以作为细胞Rca2+调节的一个新的介质，这更有利于我们理解大幅度、低频率的Ca2+波动的传播机制。将PLC‘当成精子因子的一部分有助于我们揭示卵母细胞被激活后，接下来不同胚胎发育阶段的分子机制。而要分析人类精子

2、，PLC‘也能为了解一些雄性不育的情况提供一个新的框架。此外，PLC‘也可以用来改善卵母细胞的激活效率。因此，对PLC‘的研究也就越发重要。JM8细胞是敲除了PLC‘基因的一类干细胞系，是从C57BU6N小鼠分离得到的，主要用于研究PLC‘的作用。本试验主要从JM8细胞入手，通过显微注射的方法得到嵌合体小鼠，然后通过微卫星分析来得到生殖系嵌合的小鼠，为深入研究PLC‘与Ca2+波动的关系打下基础。、通过收集8．细胞胚胎，采用显微注射的方法将JM8细胞注入胚胎中，培养至囊胚后进行胚胎移植以获得嵌合体小鼠。对出生小鼠进行统计，发现得到了46只成年毛色嵌合体小鼠，占小鼠出

3、生比例的36．22％。对嵌合体公鼠进行配种没有发现JM8细胞有生殖系传递的痕迹。对获得的成年嵌合体公鼠进行微卫星分析。提取lO只成年嵌合体公鼠的12种组织(肺、肝、脑、胰、肠、膀、胃、心、睾丸、脾、肾、肌肉)的DNA，选取2个微卫星位点D10Mitl34和D5Mitl38进行PCR扩增，检测这lO只成年嵌合体公鼠的组织嵌合度，尤其是生殖系嵌合的情况。结果发现嵌合体公鼠的大部分组织都发生了嵌合，甚至有一部分组织是完全由JM8细胞发育而来的。观察生殖系的嵌合情况，发现有4只公鼠的睾丸发生了嵌合，而另外有一只公鼠只在一个微卫星位点(D5Mitl38)上检测到嵌合，在另一个

4、微卫星位点(D10Mitl34)上则没有检测到有嵌合的情况。检测的有生殖系嵌合的嵌合体公鼠通过配种却没有发现ES细胞有生殖系传递的痕迹，更进一步的机理则需要通过单精注射等实验手段来进行深入的研究。关键词：嵌合体小鼠；PLC‘；JM8；显微注射：微卫星分析ChimericmiceproductionbyeLc(deletantJM8cellsMasterCandidate：WANGPcngboMajor：AnimalGenetics，BreedingandReproductionSupervisor．Prof．LIXiangyunAbstractPLCisaveryi

5、mportantkeyenzymeinthephosphatidylinositolsignaltransduction．PLC(iSoneoftheshortestphospholipaseCisozymes，andanowPLCthatindependentonthestructureandfunction．ThroughsomestudywefoundthatthelinksinthecatalyticdomainofthePLCc=configurationiSveryimportantforthefertilization．DiscoveryofPLCCa

6、sanovelmediatorofintracellularCapregulationwillenableanincreasedunderstandingofthepropagationmechanismoflargeamplitude,low．fi：equencycytosolicCa?oscillations．Identific撕onofPLC‘asacomponentoftheputativephysiologicalspermfactorshouldhelptorevealthemolecularmechanismsinvolvedinsubsequents

7、tagesofembryodevelopmentaftereggactivation．AnalysisofhumanspermPLC(mayalsoprovideanewframeworkforunderstandingsomecasesofmalefactorinfertilitywherethespermareineffectiveinstimulatingdevelopment．Besides，PLC‘couldbeappliedinapproachestoimproveeggactivationrates．So，theresearchofthePLC