利用锌指核酶技术制备mstn基因敲除牛胎儿成纤维细胞

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1、原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大学及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：乏垄}指导教师日签名：翟丛趔期：勃}弓，厂‘W在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可

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3、象，“双肌"牛较普通牛产肉率可提高40％左右，但通过常规杂交育种培育“双肌"牛，其育种周期长，遗传性状不稳定，而通过基因打靶技术结合体细胞核移植(Somaticcellnuclear缸独sfer，SCNT)技术可克服此缺点。本实验对牛胎儿成纤维细胞转染条件进行优化，利用锌指核酶打靶载体对其进行转染，经PCR产物测序鉴定朋研Ⅳ敲除的阳性克隆细胞系，为姗Ⅲ基因功能的研究以及后续螂研敲除牛的生产奠定基础。1、牛胎儿成纤维细胞转染条件的优化利用增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP．C1质粒，对电穿孔法及脂质体法转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞的转染条件进行优化，转染48h后，经流式细胞仪分

4、析，最高转染率分别为35．02±3．51％和44．06±0．30％，对应的转染条件分别为500v电压、4ms脉冲时间、3ug质粒和2ul脂质体、800ng质粒，相差显微镜下观察，细胞状态良好，统计学分析两者无显著性差异(P>O．05)。2、利用锌指核酶技术制备脚zⅣ基因敲除的牛胎儿成纤维细胞通过优化的转染条件，将购于Sigma．Al血ch公司的两套锌指核酶i云亭利用锌指核酶技术制备脸7Ⅳ基因敲除的牛胎儿成纤维细胞载体bMK．I(包括bZFN．1、bZFN一2两个质粒)和bMK．II(包括bZFN-3、bzFN-4两个质粒)分别导入鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中，随机挑取单细胞，建立

5、单克隆细胞系，使用跨锌指核酶作用位点的PCR引物对单克隆细胞系基因组进行PCR扩增，PCR产物测序鉴定后，最终得到在锌指核酶作用位点发生突变的单克隆细胞系。由电穿孔法介导打靶一次，获得154个单克隆细胞系，其中有1个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系，打靶效率为6．5‰；由脂质体法介导打靶两次，第一次获得83个单克隆细胞系，其中有2个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系，第二次获得316个单克隆细胞系，其中有12个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系和1个双等位基因突变的阳性单克隆细胞系，打靶效率为3．8％。相比于电穿孔法，采用脂质体法将锌指核酶导入鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，更有利于阳性

6、细胞系的制备。关键词：锌指核酶；肌肉生长抑制素；牛胎儿成纤维胞；转染；敲除内蒙古大学硕士毕业论文PREPARATIONOF彪S刀VGENEKNOCK．OUTBOVINEFETALFIBRoBLASTCELLSBYZINC—FINGERNUCLEASESABSTRACTMyostatin(MSTN)isanegatiVeregulatorofskeletalmusclegrowthanddeVelopment，andiscloselyrelatedtocellgrowthandthemmlberofmuscle助ers．删genedeletioncancausemusclel卵

7、ertrophyphenomenon，so·called¨double—muscledff．Themeatproductionof．”double—muscled，’cattlei11creasedabout40％thannomalcattle．Thebreedingcycleislong，andthegenetictraitsisinstabletoobtain”double—nmscledf’cattlethI．ou曲conventionalcross-breeding，、Ⅳhilegenetarg