中国部分地区马属动物隐孢子虫、贾第虫分子流行病学

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分类号密级英文题目：丛QL曼￡堕L△垦星里!Q旦丛!QLQ鱼YQEcRYPToSPoRlDIUM入NDGIARDIA0F学位申请人：萱复鲞导师：韭蕉现塾援专业：亟堕整医堂论文提交日期：学位授予日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论我国部分地区马属动物隐孢子虫、贾第学位文题目虫分子流行病学级别博十学学生科预防兽医学导师姓名菅复春张龙现教授专原虫病分子诊断姓名业’学位论文保密如需保密，解密时间2013年12月1同是否保密研究篙明荫砭谢■铷签孵学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离丌河南农业大学后，就在校期|T白j从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。研究尘虢芹砭锄虢狠学院领导虢同期：猁j年∥月y日同期：伽(辞苫月I同日期：年月同 本论文主要得到国家自然科学基会重大国际合作项目(31110103901)、国家自然科学基金面上项目(3172311)、十二五国家重大科技专项子课题(2012ZXl0004220—011)、国家科技支撑计划子课题(2010BAD0481)，河南省高校科研创新团队项目(012IRTSTHN005)资助。 摘要目录Abstact．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯⋯．．．．．．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．⋯⋯．⋯．．．．．．．．．1ll附图清单⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Vl附表清单⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．VlI英文及缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯VIII第一章文献综述1隐孢子种类／基冈型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．211隐孢子虫种类、基冈型和基冈垤丌j⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯21．2基I灭|分曩!r具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．3、IF丌!分型l：具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．4目前已鉴定的隐孢子虫种类和基冈型璎⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42贾第虫及其分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52．1贾第虫种类和基l灭1型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52．2贾第虫的基冈分曩4⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63主要哺乳动物隐孢子虫流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．73．1牛隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．73．2猪隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．73．3绵羊和山羊隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83．4马属动物隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83．5犬隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103．6兔隐孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯104主要哺乳动物贾第虫流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．104．1牛贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．104．2猪贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一114．3绵羊利山羊贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一114．4马贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．114．5犬贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。124．6猫贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．124．7兔贾第虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14i 4．8人感染的贾第虫种类．5结语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第二章马属动物肠道寄生虫隐孢子虫流行病学调夯l引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2材料与方法2．1样『u1米源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2试剂配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．3显微镜检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．163结果3．1弓属动物肠道寄生虫流行概况⋯⋯3．2马属动物肠道寄生虫i昆合感染情况3．3不同种类、年龄的马属动物肠道寄生虫感染情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．4不同饲养模式r‘马属动物肠道寄生虫感染情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．203．5不同季仃马属动物肠道寄生虫感染情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯214．1马属动物肠道寄十虫感染⋯4．2马属动物隐孢子虫感染情况第二章马属动物隐孢子虫SSUrRAN基冈PCR．RFLP及种系发育分析l引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．22⋯．⋯232材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．¨急孢子虫样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2．2隐孢子虫DNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2．3基丁SSUrRAN基冈的PCR．RFLP及序列分析2．3．1三种扩增试剂的比较2．3．2SSUrRAN基冈PCR扩增2．3．3基丁ISspI和VspI限制性内切酶的RFLP鉴定2．4SSUrRNA基冈PCR产物测序．2．5部分样品的种系发育分析⋯⋯．．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3．1三种试剂扩增效果比较⋯⋯⋯⋯．456●68●巧拍卯892● 3．2SSUrRNA基冈PCR扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一293．3基丁Sspl和Vspl限制性内切酶的RFLP鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．4部分样品种系发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．5不同隐孢子虫种类的年龄分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．5不同隐孢子虫种类的年龄分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯394讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404．1芙r马属动物隐孢子虫种类／基冈犁⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．2不同年龄马和驴隐孢子虫种类／基冈丌!⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404-3马属动物隐孢子虫种类地域分布与养殖方式的父系⋯⋯⋯⋯⋯，⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．5马属动物隐孢子虫显微检查和基冈扩增效率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44第四章马属动物隐孢子虫gp60基冈的qF型分型研究1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452材料L．／方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．1隐孢子虫样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．452．2基丁-gp60基冈、IF型分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．3gp60基冈弧砷9命名⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．462．4gp60基冈PCR产物凝胶电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．5gp60基冈PCR产物洲序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．1gp60基冈扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46gp60基冈弧巧!鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．463．3gp60优势、lF型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474讨1仑．．．．．．⋯．．．⋯．．⋯⋯．⋯．．．⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯．．．．．．．⋯．．⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．494．1马属动物隐孢子虫、IF一!⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．2驴隐孢于虫Ⅱ型的人兽共患风险⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．第五章马属动物贾第虫基TTPI和GDH基冈的种系发育分析l引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2．1贾第虫样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2．2贾第虫基冈组DNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．50⋯⋯⋯⋯⋯．51⋯⋯⋯⋯．⋯5l⋯⋯⋯⋯⋯．．5l⋯⋯⋯⋯⋯．．51 2．3TPI基冈和GDH基W引物2．4PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2．5PCR产物检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2．5PCR产物测序及种系发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．1TPI基冈序列比对及种系发育分析⋯⋯⋯⋯⋯3．2GDH荩闪序列比对及种系发育分析3．3驴贾第虫优势种类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5l⋯⋯⋯⋯⋯．．53⋯⋯⋯⋯．5354553．4驴贾第虫年龄和地域分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．554讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55结论⋯⋯参考文献敏酣⋯⋯作者简介4．1马属动物贾第虫流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．2驴隐孢f虫和贾第虫流行种类的独特性4．3驴隐孢子虫币¨贾第虫人兽共患风险分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯58．．59．．60．．75．．77 摘要隐孢子虫是一种重要的人兽兆患原虫病病原，可以感染260多种脊椎动物，主要引起肠胃炎和急慢性腹泻为主的隐孢于虫病，已在106个国家的人群中发现隐孢子虫病的流行。隐孢子已成为人类6种常见腹泻病的病原之一，同时它也是150种水传疾病病原中最重要的一种。很多动物是人兽共患隐孢子虫的宿主并¨人感染隐孢子虫的米源。贾第虫是全球分布的脊椎动物普遍存在的肠道寄生虫，该虫主要是通过食物或者饮水传播，可引起动物腹泻，也是人类常见的腹泻病原之。。多种动物如家养幂¨野生反刍动物及犬、猫、兔及其他啮齿动物等是人兽共患贾第虫的贮存宿主，冈此，动物的隐孢r虫和贾第虫流行情况和基冈犁分布受剑人们的重视。为研究我国马属动物中隐孢子虫利贾第虫临床感染情况及其公共IJ生意义，从2008．20】1年问，从河南，ilI尔，内蒙占，甘_肃，河，IL，四川等省K的部分地区分别采集驴、马、骡粪便样品1063、203、36份，经饱利蔗糖溶液漂浮法和卢戈氏碘液染色法检布，共发现寄生虫附I生粪样921份，其中球虫、蛔虫、划线虫、绦虫、其他寄生虫tji,J／7l,J囊／包囊感染率分别为7．14％、12．6％、55．99％、3．53％、4．53％，两种及其以上寄生虫混合感染率2．58％。不同米源的马属肠道寄生虫的附降率从31．94％一100％之间，总|jI|．|生率为70．74％，各地马属动物肠道寄生虫混合感染率从0-70％不等。内蒙占军马场的罕马感染率最低为31．94％，j昆合感染率为2．08％。骡的线虫和隐孢Ji虫的感染率较马、驴的低。6月龄以卜的马属动物隐孢子虫和线虫的感染率分男0为29．21％和86．14％，较612月龄和成年动物高；集中养殖方式马属动物各种寄生虫的感染率均高丁农村散养动物。本次调布共检山隐孢子虫疑似样晶222(17．5％)份，感染强度较低，以幼龄马属动物感染率较高。马属动物的隐孢子虫近圆形，人小在59m左也。Ⅲ基丁SSUrRNA基冈的PCR．RFLP分析鉴定以及DNA序列分析鉴定技术对上述222份隐孢子虫|j|I性或疑似样品进行基冈分叶9，结果发现，222份附|生和疑似样品有114份扩增山目的条带，i11．凋布总数的8．76％。其中51个样品进行序列刈0定。经RFLP分析和种系发育分析，共鉴定出6个隐孢子虫种类／基冈删：Cryptosporidiumdonkeygenotype，C．parvum，horsegenotype，C．cuniculus基冈型，Cryptosporidiumpjg1，ferretgenotype。其中新基冈型有86个样晶，donkeygenotype为优势种类，其次为C．parvum共12个样品。2个样『销属y-horsegenotype，2个为ccunwulus，2个为Cryptosporidiumpigl。住12个C．parvum样品中，驴的样品11l到9份为72．73％，马的样品为27．27％，表明马和驴的隐孢子虫均有人兽共患隐孢子虫种类。donkeygenotype是6月龄以‘卜驴驹感染的主要隐孢子虫种类，两个horsegenotype样品均米白驴驹。本试验发现马『'I是白然感染隐孢子虫C．cuniculus和ferretgenotype的新宿主。 经SSUrRNA基冈扩增鉴定的附陛样品进一步川gp60基I灭l进行Ⅱ型分型，发现获得的扩增产物分属二个不同的孤家族：Ild、vI和一个新的弧犁家族，按照gp60亚型的命名原圳9将新Ⅱ犁命名为xlI：二种不同弧家族中，共发现四个弧型：horsegenotype家族v1中两个样品均是VIAllG3Ⅱ型，lidⅡ家族中两个样^^均属IIdAl9G1，在新家旅中，有两个样品属丁XIIAl6弧开!，其余19个都为XIIAl6Gl弧)聪。所属XII家族样品数量为21个，l’|．84％，其余两个、lF叶!所lIi比例荇为8％，平¨基厂SSUrRNA的分类结果一样，donkeygenotype为优势种类。其中horsegenotype、IIdAl9G1是人兽共患隐孢子。基冈Ⅱ型XIIAl6、XIIAl6Gl是新发现的驴隐孢子虫基冈弧型，而t：1．在成功扩增的25个gp60样鼎中，XIlAl6G1是优势哑砷9，该弧型对动物的致病力、是否对人具有感染性尚不明确，需要进‘步的试验探索。对部分驴粪样品进行贾第虫TPI基冈利GDH萆冈扩增弗测序，共有4份TPI基冈⋯性，7份f3Dll基冈Fil性，经搜索同源序列、CluslalXl．83比对、phylip3．69进化分折，发现扩增出的4个TPI序列中的3个属丁聚集体BIV，与聚集体BIV仅有2个碱基的变异；另-个TPl刚性样品属丁聚集体AI。扩增的7个GDH序列均属聚集体B1V，两个基冈位点分析的共8个贾第虫样，铺均属丁人兽共患的聚集体A、B，这!j文献报道的马的贾第虫土要种类为聚集体E有明显斧别。以上研究探明了我国部分地区马属动物肠道寄生虫感染总罔|性率70．74％，其中圆线虫，球虫，蛔虫分另J为55．99％，7．14％、12．6％。隐孢子虫|j||_陆和疑似阶|生率为17．5％，经SSUrRNA基冈鉴定的⋯性率为8．76％。马属动物尤其是驴隐孢子虫基冈分型显示有6个隐孢』i虫种类／基冈，I!，其qadonkeygenotypeJ,J新基冈啊!，同时也足我同驴感染的优势虫种，(ip(．IFVZllll，horsegellotype为人兽共患种类／墓冈型，I而C．clmicldlts利ferretgenotypefl'j检出表明驴为这两个种类的新宿卡。gp60弧珥4分析共发现3个不同iIF叶4家族，4个弧7I!：IIdAl9G1、VIAllG3、XIIAl6、xIfAl6G1，后两者是首次发现的瑚、隐孢子虫弧矸9。马属动物贾第虫基冈分刑结果发现两个基冈巧!：聚集体AI干IIBlV，斤者是优势弧型。尽管donkeygenotype生物学特性如是否具有人兽J∈患性尚不消楚，但cpw—VIIHI利horsegenolype的及贾第虫聚集体AI$11BIV的发现表明我国马属动物是人隐孢子虫和贾第虫感染的贮存宿主，其中C．pa；wumlidAl9G1也是河南人隐孢子虫流行的Ⅱ型。冈此，虽然码属动物隐孢子虫和贾第虫的感染率不高，感染强度不人，住动物本身并不表现山临床症状，但作为贮存者利携带者在人隐孢子虫和贾第虫感染中所扮演的角色却不容忽视。关键词：马属动物；隐孢子虫；贾第虫；种类；基因型；基因亚型 AbstractCryptosporidiosisisanimportantzoonoticprotozoandisease．Cryptosporidiumspp．caninfectmorethan260speciesofvertebrateanimalsandcancausegastroenteritisandacuteandchronicdiarrhea，withtheprevalencebeingfoundintheworld．Cryptosporidiumhasbeenfoundinhumansinonehundredandsixcountries，whichisoneofthemostcommonsixpathogenforhumandiarrheaanditisoneofthemostimportantpathogeninthe150water-borndiseases．Cryptosporidiumcaninfectdomesticanimalsandvariouswildlife，andmanyanimalsaretheinfectionsourceofzonnoticCryptosporidiumspp．Likewise，Giardiaisuniversalintestinalparasitefoundinvertebratehosts，withaglobaldistribution，whichistransmittedbyfoodorwater．Giardiacancausethediarrheaofanimalsandisoneofthecommonpathogenforhumandiarrhea．Afewanimalssuchasdomesticandwildruminants，dogs，rabbits，cats，rodentsarethereservoirofzonooticGiardia．Therefore，theprevalenceandgenotypedistributionofGiardiabroughttoextensiveattention．TodiscusstheprevalencestatusofCryptoaporidiumandGiardiainequinesandtoassessthepublichealthsignificanceofthetwoparasitesinChina，between2008and201i，i063，203，and36fecalsampleswerecollectedfromdonkey，horse，andmuleinthepartialareasofHenan，Shandong，Neimeng．Gansu，Hebei，andSichuan．ThesampleswereexaminedusingtheSheatherjSsugarflotationtechniqueandtheLug’Siodinestainmethod，921sampleswerepositiveforparasites．Inwhich，theinfectionrateofCoccidium，Ascaris，nematode，cestode，andotherparasiteeggs／oocysts／cystswas7．14％，12．6％，55．99％，3．53％，and4．53％，respectively．Therateoftwoormorethantwoparasitesmixedinfectionwas2．58％．Theoverageprevalenceofintestinalparasiteswas70．74％invariousequines，ranging31．94％to100％．Themixedinfectionrateofequinesindifferentsitesvariedfrom0to70％．Thelowestprevalencewas31．94％forthearmyhorsesinNeimeng，withthemixedinfectionrateof2．08％．TheprevalenceofnematodeandCryptosporidiumspp．inmulewasrelativelylowestamongthehorse，donkey，andmule．TheinfectionrateofnematodeandCryptosporidiumspp．wasrespectively29．21％and86．14％inlessthan6-month—oldequines．whichwashigherthanthatin6to12一month—oldandadultanimals．Theinfectionrateofparasitesinequinesunderthelargescalebreedingpatternwashigherthanthatofequinesinscatteredbreedingstyleinruralarea．TheCryptosporidium—positivesuspectsampleshadtwohundredandtwentytwo(17．5％)， andtheinfectionintensitywaslowwiththeyoungerequineshavingthehigherprevalence，Theoocystsfoundinequineswereclosetocircularshape，withthesizeofabout5p．m．Atotalof14sampleswereCrypto。WoJ’idiumpositivefromthe222suspectsampleswassuccessfullyamplifiedgenotyped．whichoccupied8．76％ofthetotalnumberofsamplesinvestigated．FiftytwoPCRproductsweresequenced．PhylogeneticanalysisshowedthattherewerefiveCryptospo“diumspecies／genotypes，includingCryptosporidiumdonkeygenotype．Cparvum，horsegenotype，C．cuniculusCsuis．Amongwhich．theCrypto．woridiumnewgenotypewasthepredominantparasitewasfoundineight57sixsamples，followedbyC．pw’vRm(n212)．Allthenewgenotypesamplescamefromthedonkey，thus，thedonkeygenotypewasproposedinthisstudy．Amongthe12C．parvum—positivesamples．ninethreecamefromhorseoccupiedfol’72．73％and27．27％，respectively．TheresultsuggestedthathorsedonkeywereallinfectedthezonooticCpapvum．Thedonkeygenotypewasthemajor('r)q)lo,spol+idiumspeciesinlessthanhalfyeardonkeyfoals，likewise，thetwohorsegenotypesampleswereallcomefromdonkeyfoals．Itwasfoundforthefirsttimethatdonkey'wasthenewhostofCcuniculusinthestudyforthefirsttime．Subtypingbasedongp60genewasperfin’reedtotheCryptosporidiumpositivesamplesbySSUrRNA．Threesubtypefamlieswcrcfound，includingVI，IId．andXII．TwohorsesamplesbelongedtoVIAl1G3，twoC．parvumhadIIdAl9G1，twodonkeygenotypesbelongedtoXItA16theother19sampleshadXIIA16GI，respectively．Amongthethreesubtypefamilies，XIIfamilyhad21samplesoccupiedfor84％，whereastheothertwosubtypesoccupiedfor8％each．whichwasidenticaltothegenotypingresultsbySSUrRNAgenethatdonkeygenotypewasthepredominantCrypto,woridiumspecies．TheC1．parvumIldAl9G1wasthezonooticsubtype．XIIA16XIIA16G1werefirstidentifiedsubtypesindonkey，andwerethemajorsubtypesfoundin25samplessubtypedbygp60gene．However，thepathogenicitythepossibilityofzonootictransmissionarestillunkown．Thus，furtherstudyisneededtobetterunderstandthese．GiardiawasamplifiedbyTPIGDHgenesinpartialofsamplesfromdonkey．FoursevensampleswereGiardia—positivebyTPIGDHgenes，respectively．ThePCRproductsweresequencedthesequenceswereanalyzedusingsofiwaresofClustalX1．83Phylip3．69．IntheTPIgene，threesamplesbelongedtoV assemblageB—IV，withonlytwonucleotidedifferences，onesamplehadA—I．IntheGDHgene，sevensamplesallbelongedtoB-IV．Thus，theeightGiardiasamplesallbelongedtothezonooticAorB，whichhadsignificantdifferenceincomparisontopreviouslyreportedthepredominantEfoundinhorse．Thetotalprevalenceofintestinalparasiteswas70．74％inthisstudy，inwhichtheinfectionrateofStrongylid,Coccidium，Ascaris，was55．99％，7．14％，12．6％respectively．ThepositiveandsuspectedpositiverateofCrypto,woridiumwas17．5％．SSUrRNAgenedetectedratewas8．76％．Genotypingstudysuggestedthattheresixspecies／genotypesisolatedfromEqURSespeciallyformdonkey，donkeygenotypeisthepredominantCryptosporidiumspeciesinequines，followedbyzonooticCparvumandCrypto．woridiumhorsegenotype，thelatertwowerezoonoticspecies，whileC．cuniculuswasfoundindonkeyforthefirsttime．Threesubtypefamlieswerefound，includingVI，lid，andXII，inwhichIIdAl9G1，VIAl1G3，XIIAl6，XIIAl6G1werefoundbasedongp60geneanalysis，XIIA16、XIIA16G1werenewsubtypesfoundindonkeyforthefirsttime．ThereweretwogenotypesAIandBIVwerefoundinGiardia,thelateronewasthedominatesubgenotype．Althoughthebiologicalcharacterizationsuchaszonootictransmissionpossibilitywasunclear，thefindingofCparvum，Cryptospol‘idiumhorsegenotype，GiardiaAIandBIVindicatedtheequinesarethereservoirforhumanCryptosporidiumandGiardiainfections，meanwhile，CparvumIIdAl9G1wassubtypelbundinhumanofHenanprovince．Therefore，althoughlowinfectionrateandinfectionintensityofCryptosporidiumandGiardiawereobservedandnoobvioussymptomwasseen，thatequinesmightplayallimportantroleinthehumanCryptosporidiumandGiardiainfectionsshouldnotbeneglected．Keywords：Equus；Cryptosporidium；Giardia；Speceis；Genotype；SubgenotypeV 附图清单图2-1圆线虫卵图2—2马副蛔虫卵图2—3马裸头绦虫卵图24钩虫卵图2—5未孢子化的马球虫卵囊图2-6孢子化的球虫卵囊图2-7隐孢子虫卵囊图2-8已孵化幼虫的卵图2-9本研究中采样点分布图图2-10马属动物肠道寄生虫混合感染情况图3-1三种不同试剂的扩增效率比较图3-2隐孢子虫分离株SSUrRNA基因PCR扩增结果图3—3部分样品的酶切图谱图3—4部分样品基于SSUrRNA基因的初步分群图3—5代表序列基于SSUrRNA基因Neighbour-joining法(Kimura2-parameter模型)构建的种系发育关系进化树图3—6马属动物隐孢子虫种类所-与比例图3—7部分SSUrRNA序列ClustaIXl．81比对的主要变异区域截图图4—1部分样品gp60基因扩增产物电泳结果图4—2马属动物隐孢子虫gp60序列和人源序列的聚类分析图4—3基于gp60基因的不同亚型家族组成比例图5-1基于TPI基因Neighbour-joining法(Kimura2-parameter模型)构建的驴贾第虫种系发育关系进化树图5-2部分样品GDH基因扩增产物电泳结果图5—3基于GDH基因Neighbour-joining法(Kimura2-parameter模型)构建的驴贾第虫种系发育进化树Vl 附表清单表1-1已报道的家畜隐孢子虫基因型表1-2主要贾第虫种类和Gduodenalis的基因型表卜3马属动物隐孢子虫病及分子流行病情况表1-4目前已报道或GenBank上查到的ccuniculus人感染病例及其分型表卜5牲畜中贾第虫的感染率和基因型表1-6贾第虫在发达国家和发展中国家的感染率和基因型表2—1马属动物肠道寄生虫检出情况表2—2马属动物肠道寄生虫混合感染情况表2—3不同动物种类肠道寄生虫感染率表2-4不同年龄组动物肠道寄生虫感染率表2—5不同饲养环境下马属动物的肠道寄生虫感染情况表2—6同一采样点不同季节马属动物肠道寄生虫的检出情况表3—1用于隐孢子虫基因分型的SSUrRNA基因引物表3—2SSUrRNA基因PCR扩增反应体系(25uL)图3-3部分样品的酶切图谱表3-4SSUrRNA基因相似序列差异比对表35基于SSUrRNA基因扩增产物酶切及测序鉴定分类表3—6马属动物隐孢子虫种类／基因型分布表3-7主要隐孢子虫种类地域分布表4—1隐孢子虫亚型分型的gp60基因引物表42gp60基因亚型鉴定参考序列表4—3gp60基因亚型分型表4—4cparvumgp60亚型家族在人的分布表5—1贾第虫TPI基因引物表5—2贾第虫GDH基因引物表5-3PCR扩增反应体系(2511L)表5_4驴贾第虫TPI序列差异比较表5-5马属动物贾第虫基因／亚型分型表5-6贾第虫在动物中的感染率和基因型表5—7本研究鉴定隐孢子虫和贾第虫种类及人兽共患性V11 英文及缩略词表英文缩写英文名称RNARibonucleicacidDNADeoxyr．bonucleicacidSSUrRNASmallsubunitribosomeRNAgp6060kDaglycoproteinCOWPCryptosporidiumoocystwallproteinHSPheatshockproteinActinPCRPolymerasechainreactionR●PCRReversetranscription—polymerasechainreactionRFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphismLAMPloop—mediatedisothermalamplificationRAPDRandomamplifiedpolymorphicDNAbpBasepairMLSTMultilocussequencetypingMLTMultilocusTypingSNPSinglenucleotidepolymorphismP2323kDaProteinDHFRDihydrofolatereductaseITSInternaltranscribedspacersTRAPThrombosponditim—relatedadhensiveproteinCP56MucinlChrom3TUnlVPSGDHTPlELFAB—giardinHIVAIDSIFAr．min℃mg·mL一1U·uL叫dNTPsBSABLASTNJ56kDaproteinMucin—likeproteinT-richgenefragmentMjcronvariablesurfaceproteinglutamatedehydrogenasetriosephosphateisomeraseelongationfactor1alphabetagiardinHumanImmunodenciencyVirusAcquiredimmunedeficiencysyndromeImmunofluorescenceantibodyRollperminuteCenti—degreeMilligrampermilliliterUnitpermicroliter2"-Deoxyribonucleoside5"-triphosphateBovineSeFtlmalbuminBasiclocalalignmentsearchtoolNejghbourjoiningVlit中文名称核糖核酸脱氧核糖核酸小弧基核糖体RNA60kDa糖蛋白隐孢子虫卯囊鼙生白热休克蛋白肌动蛋白聚合酶链式反应反转录聚合酶链式反应限制性片段K度多态性环介导等漏扩增法随机扩增的多态性DNA碱基对多何点序列分巧!多何点分叶!单核茁酸多态性隐孢子虫23kDa岱白。氢什l‘酸还原酶内转录间隔区凝Ⅱ玎酶敏感蛋Ff相关黏附蛋白56kDa蛋向粘蛋向T富集区基冈片段微米可变表面蛋白谷氨酸脱氢酶磷酸丙糖异构酶延K冈子0【1B一贾第素人类免疫缺陷病毒获得性免疫缺陷综合症免疫荧光抗体每分钟多少转摄氏度每毫升多少毫克每微升多少单能脱氧核糖核苻二磷酸牛血．清白蛋白碱基局部对准检索I：具邻接 河南农业大学博：f?学位论文第一章文献综述第一章文献综述隐孢予虫和贾第虫是两种重要的人兽共患原虫病病原，可白然感染260多种脊椎动物，主要引起肠胃炎和急慢性腹泻，人表现腹泻、恶心、呕吐、身体不适等症状，ttc界各地广泛流行。隐孢子虫⋯是重要的机会性感染原虫，往艾滋病(AIDS)病人中感染率高达48％12J。该虫已成为人类6种常见腹泻病的病原之一。冈其可引起艾滋病病人致死忭腹泻，被相关组织列为艾滋病的诊断指标之一：隐孢子虫主要有接触传播(directcontact，person—to．persontransmission)、人兽共患传捅(zoonotictransmission)及食源或水源传播(foodbornetransmission、waterbornetransmission)|11。隐孢子虫也是150种水传疾病病原中最重要的一种，1993年引起美国威斯康星州密尔奥基市40多万人感染，近白人岁E亡，经济损火近亿美元。已有的报道发现断奶前犊牛是C．册，叫M7主要动物宿主，犊牛可能是人兽共患隐孢子虫病的最重要传染源。与感染犊牛接触可能是兽医专业学生、研究人员和参加农业活动的儿童多次隐孢子虫病暴发的原冈。牛粪污染食物；：f|I饮水曾经是多次食物传捅幂¨饮水传捅隐孢予虫病的原冈，在病例对照研究中，与牛接触是荚国、英国、爱尔兰和澳人利弧人隐孢子虫病散发病例的主要风险冈素。威斯康旱散发病例隐孢子虫弧，弘分析支持了人(’pal—vM，传播中犊牛起着重要作州的结论，绝人多数病人儿乎仅感染(1．p卯v堋7。住这些病人中发现的许多弧型以前也发现丁．相邻的密阳根平¨安人略的犊牛。少数流行病学研究揭示绵羊是人隐孢子虫病的传染渊。某些情况r，犬可能是人隐孢子虫病的重要感染源12J。上述发现表明多种家备利野生动物在隐孢子虫传橘给人的过榉中起着一定的作_Hj。美国疾病控制预防中心(CDC)将其列为B类生物战刷，欧美国家已经将隐孢子虫列入水质经常性监测的病原微生物。鉴丁此，我国新的水质标准《城市供水水质标准》(CJ／T206．2005)和《生活饮刚水质量标准》(GB5749．2006)也均把隐孢子虫和贾第虫列入水质的检测指标之一。在隐孢子虫和贾第虫的符种传橘方式中，由动物传播给人的人兽共患的隐孢子虫和贾第虫种类倍受重视，它们所住的动物宿主及传播途径也是目前研究的热点。很多动物，如奶牛，绵羊，猪，犬，兔等动物中已经发现了人兽共患种类，而这些动物与人的生产生活密切相关，患病动物所携带的病原往往可以通过污染环境、水源、蔬菜水果等而传播给人类。卜面就隐孢子虫、贾第虫种类、基冈曩!和主要家畜两虫的感染情况做一综述。1．隐孢子种类／基因型鉴定1．1隐孢子虫种类、基因型和基因亚型随着对隐孢子虫的研究深入，学者们发现，以形态学、生活史、宿主特异性等作为分类依据很难将隐孢子虫区分开米，尤其是环境中的隐孢子虫，单纯凭形态学特点分类更加凼难。分子生物!学的发展为隐孢_子虫的分类利基冈巧4及Ⅱ弧《鉴定和传播途径的研究提供有效的途径和分析．I：具，尤其是近年来的发展更为快速。隐孢子虫种类的确立主要基丁以卜儿个方面l-{。4J：(1)卵囊的形态：(2)虫体遗传特征； 河南农业大学博士学位论文第一章文献综述(3)自然或试验感染宿主的特异性；(4)符合国际动物命名法规(InternationalCodeOfZoologicalNomenclature)。基冈丌4的命名是指在发现有足够的的SSUrRNA基冈(SmallsubunitribosomeRNA)或者其他基冈荠异，以及需要通过系统发育分析排除这种差异是由丁．SSUrRNA基冈拷贝之间的异质性或者内部基冈变化导致的。基冈型的命名规则通常反映隐孢子虫之间的筹异，也趋丁和生物学特性著异相关联，但不是所有的基冈玎!都能同样相互区别。冈此，一些基冈型显示与同类属基冈序列存住人鼙的核营酸差异，彼此间很相似的那些基冈主要门冈丁I寄生虫利宿主的共进化。Ⅱ型或者Ⅱ基冈，性有时fL}』_I。描述相对较小的基冈7叫内变异，特别是针对CryptosporidiumparvttlT?f(’口一wm，j平¨Chomi”曲这两个感染人的主要种类。涉及弧型鉴定主要川丁．地方性的隐孢子虫病或感染的病原传捅和污染米源研究，冈为隐孢子虫分类的不确定性，导致在隐孢子虫研究领域的基冈型和基冈亚斗9的术语和其他领域不一样。研究者应尽量避免在较小的序列筹异而命名一个基冈刑，此外研究者应尽苗少川I同的术语，以减少不必要的{昆淆。1．2基因分型工具Laxer等(1991)151年首次运川PCR技术检测粪便样晶的隐孢子虫，此，|亓，很多PCR方法开始川丁检测临床或环境能够中的隐孢子虫。白从以PCR为基础的1．具可以彳『效区分开cparvum和chominis(Morganeta1．，1995)I”J很多基冈分曩!l‘具开始麻州T-隐孢子虫流行病学研究。PcR引物土要以多种抗原基冈、结构基冈、持家基冈平¨某些木知基冈组的片段，以及多种方式的检测和鉴另0方法。包括单个循环(single-round)和巢式PcR(nestedPCR)，随机扩)曾DNA基冈多态性(randomarnplifiedpolymorphicDNA，RAPD．PCR)、随机引物PCR(arbitraryprimedPCR，AP．PCR)、反转录PCR(，reversetransct‘iptionPCR，Rq、-PCR)，实tt寸PCR(real-timePCR)，后米的RFLP(restt’ictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)分析，单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)、酶联免疫吸附试验(enzyme．1inkedimmunosorbentassay，ELISA)，芯片(microarray)或者DNA测序¨1(Egyedeta1．，2003)。理想的分子诊断I：具麻可鉴定所有的种类或基冈型，或者能够检测所有感染人的种类，但是目前只柏‘少数方法可以做剑这点，究其原冈，住很人程度上冈为在隐孢子虫种类和基冈啊!水平上，只有少数基冈位点可JL}』，如小弧基核糖体rRNA(SSUrRNA)基冈、卵囊擘蛋白(COWP)基冈、70kDa热休克蛋白(HSP70基冈)、肌动蛋白(actin)基冈等，冈为在HSP70，COWP，平¨actin基冈中，隐孢子虫种类存往序列多样性，很难殴计一个有效的属特异性的基|灭1引物，这点限制了他们在隐孢子虫分子流行病学中的席川。基T-SSUrRNA基网的属特异性的PCR．RFLP技术川丁-鉴别隐孢子虫的种类利基冈一4。由Johnson等(1995)18]该PCR方法可以扩增多种隐孢r虫种类，也可以州DNAil)10序进行鉴定。SSUrRNA基冈广泛虑Hj丁隐孢子虫基冈分巧!很人祥度上源丁该基冈的多拷贝特性，以及存在、卜保守和高变区域，适合丁设计属特异性引物。不过在选择引物序列时，需要注意的是隐2 河南农业大学博士学位论义第一章义献综述孢子虫的保守序列在其他真核生物中也同样存在，否则就导致扩增结果的特异性著，这也是早期对复顶门寄生虫非特异性扩增的原闪【9]。但SSUrRNA基冈的不足之处在丁不同拷贝间存在微小的序列差异，这有时会导致某一虫种或基冈蚕!RFLP分析结果不一致，冈此，区别不同分离株不同拷贝序列内部蒡异是很有必要的㈣。COWP基冈，为编码隐孢子虫卵囊墅蛋白的基冈(Cryptosporidiumoocystwallprotein)，该基冈具有广泛的多态性．这些著异在一定程度上可以反映不同虫种间基冈序列的差异性．可以鉴别部分虫种。该基冈经nestedPCR扩增，产生‘个约550bp的片段，叮以有效鉴别￡paFVlllll不同基冈型、emuris并llC．serpentisI引。Spano等I’11川该基冈在豚鼠隐孢子虫病样品中_L}jPCR—RFLP方法|叉：分了形态利抗原与fpal4VLIIll相似的c：wraiz‘?。两种隐孢子虫在COWP基冈序列的筹异在核酸利氨基酸水平的筹异在98—99％。但由丁‘特异性筹，基j-．COWP基冈的分刑f：具应州相对较少，但COWP基冈常用丁_新宿主(_：paz’VUlll雕J鉴定。HSPs．热休克蛋白家族(heatshockproteins，Hsps)是一群进化上高度保守的管家基冈家族，其功能主要做为分子伴侣辅助蛋白折替和转运。该家族分子革人小不同，其中Hsp70基冈在进化上高度保守且没有内含子，住隐孢子虫基冈分裂上虑州较多。通过对该位点补充分析，已确立许多独立种平¨基冈刑。Gobetll2]等利刚PCR--RFLP技术分析了cpal·v“卅的HSP70基冈的587个碱基．能检洲和鉴别C，parvum的两种基冈型，经所玎∥：f,tlScal酶切斤产生特定的图谱模式，通过对发表隐孢子虫序列比较，两个酶切组合可以JL}J丁其他隐孢子虫种类和基冈型的|又：分，特另0是(’．meteagl’idis平¨cpal·v“Ⅲ的‘dog‘genotype这两个感染人的种类。此外．Feng等T2009[13J年建立了基THsp90基冈分型方法川了二准确防：分感染人的隐孢子虫种。Actin基因，是编码肌动蛋白的基冈。肌动蛋白是真核细胞中将遍存在的高度保守蛋白之一，由丁其1}编码序列著异较人，I灭|此可以反映隐孢子虫的进化程度。Sulaiman等20021¨I戍川对多种隐孢子虫(C．parvum，C．andersonLC．baileyLC．fezes，Cmeleagridis，C．InUl。is，C．saurophilum，C．serpent厶，利Cwrais。fJ及(1~parvumILJ不同基冈型虫株的actin基冈进行了扩增和比对分析，结果确证了隐孢子不同种类利微小隐孢子虫的不同基冈曩!中间存在遗传学著异，系统进化树分析年¨之前报道的基T-SSUrRNA、HspT0基冈、COWP基冈获得的结果人体一致。1．3亚型分型工具基冈分型不能将人源隐孢子虫与人兽共患的隐孢子虫区分开米，冈为这些分型I：具分辨率较低，使其在流行病学调查中使川受限。相反，弧型分型T具在对CpatⅥ删和chominis的流行病学研究中得以发展。比如微下星(microsatelIites)和小甲星(minisateIlites)l：具【15,16碌l60一kDa糖蛋RJ&阕(GP60)[17,18]、及双链(double．stranded，ds．)RNAh粥}t19,20]和rRNA内含了转录问隔区2(theinternaltranscribedspacer．2，ITS．212t,221，这些靶丛冈较用于分型的侍点有较高的进化率。 河南农业大学博一1：9位论文第一章文献综述微卫星或者小卫星，是DNA中由卜4个bp的(微p星)或者更多的(小甲星)重复序列串联组成。由丁．复制的错误，这些序列比核心区基冈的进化率高，往往表现为微Ij昂或小甲星的串联重复数的变化，冈此能够通过PCR产物分级或者川传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳、基I灭l扫描技术区别不同弧刑。然而，很多微卫星和小卫星的多态性多以单核前酸多态开l!性(singlenucleotidepolymorphisrns，SNPs)的形式而不是重复序列数的变化米表现。这些基冈通常川J‘群体遗传研究。gp60靶点，和微甲早序列相似，是由系列编码丝氨酸的串联核酸序列TCA／TCG／TCT编成，主要_L}j丁(1．pal-violin和IC．hominis分类的gp60基冈除了二核甘酸串联重复，住1r重复区也存在基冈著异，根据这些差异和重复，将c．hominis分为a，lb，Id，le，剥II鹏亚家族，把C．parvum分为lIa，Ilc，lid，平¨Ile等弧家族。住每个Ⅱ型家族内，t要根据三联密码子的重复数|叉：分不同亚型。gp60基冈是最具多态曩9的基冈，是隐孢子虫弧型鉴定巾戍州最广的粑点。不像其他弧曩!分析I：具如ds—RNA，ITS一2，和传统的微下星利小甲星，这些通常都是1r功能性的基冈，而gp60是何丁隐孢子虫入侵--41,日"r2主阶段虫体表面顶端的具有中和抗体作州的主要生向【23．24]。冈此，它可能与在同、IF丌!家族中隐孢子虫的生物学特点和临床表现相关‘251必须注意的是多数的、IF巧4分析I：具都是建立在Cparvum或者('．hominis的基冈组序列基础上的，以至丁这些l：具只能扩增山与这两个种类相近的隐孢子虫如c．meleagl-idis，他ffJ通常不能扩山遗传距离较远的在白然感染人的(T-curtis，(’尼lis，(1_sttis，和(1，玎w打隐孢子虫1261。】．4目前已鉴定的隐孢子虫种类和基因型目前已经鉴定的隐孢子虫有效种类仃24种11．27]o哺乳动物特}j0是家养动物的感染的主要种类彳丁以卜儿种：(一pmwum，感染谱最广泛．包括人和多种哺乳动物都发现该种寄生，是最总要的人兽共患隐孢子虫种类【2圳；兔隐孢子虫(1．cuniculus，以前曾称为rabbitegenotype，以兔为主要宿主俐；Cubiquitum以哺乳动物利人为主要宿主【27】；C．bov#，以前曾称为C．parvumbovinegenotype，是以牛、绵羊为主要宿主的隐孢子虫，寄牛丁肠道，也是新发现的人兽共患种类p‘)】；(ic臼，7“犬感染的主要隐孢子种类，也有从人分离的报道pl】：C店凰猫的主要隐孢子虫种类132]；Cs“is猪的主要寄生种类I”1；C．Andersoni牛的胄内寄生的主要种类㈣。C，m臼Di，以绵羊为主要宿主，是形态较小的肠道寄生种类Fs]：C．，yanae是目前发现的最小的隐孢子虫，住牛肠道寄生【10J。在家畜中流行的主要弧喇见表1．1。有11个弧叶9为家眚流行，另有至少63多个弧型分布丁鼠类、禽类、貂、鱼类等多种动物中，在此不再一一列举。4 洲南农业大学博士学位论文第一章文献综述表卜1已报道的家畜隐孢子虫基因型Tablel-2GenolypesofCryptosporidiumreportedinthelivestocks随着分子分掣技术的发腱利在隐孢子虫研究中的虑_L}j，人们对隐孢子虫的认识和了解也越米越多丰富，利原来形态学鉴定、宿主和生物学刑研究等相结合，使隐孢子虫分类和鉴定更为科学、准确。隐孢子虫基|灭1分啊!标记住流行病学的应用，帮助人们认识隐孢子虫流行规律，使人们能在基冈形、弧型水平上理解隐孢子虫的传橘途行、群体遗传规律、寄生虫与宿主相互作川机制。2．贾第虫及其分类贾第虫：义称小肠贾第虫(G．intestinalis)或十二指肠贾第虫(G．duodenalis)，是全球分布的脊椎动物背遍存在的肠道原虫，主要引起以腹泻为主的肠道疾病，寄生。J：人及某些哺乳动物的小肠内，以十二指肠为多见。该虫主要通过食物或饮水传捅，可引起动物腹泻，也是人类腹泻的常见病原。它也是一种机会致病性原虫，住艾滋病病人中常发现有贾第虫的感染，住同性恋人群中亦可互相传橘，故本病的重要性已引起各国重视。在发达国家和Ⅱ洲，人约2000万人感染贾第虫病，1F洲平¨拉J‘美洲每年人约50000个有症状的病例13”。很多家养和野生动物也是贾第虫的携带者，冈此动物铍认为是人兽共患贾第虫的储存宿主，动物的贾第虫流行情况和基冈型分布受到人们的重视。2．1贾第虫种类和基因型最初阶段贾第虫种类的描述是根据动物宿主信息描述，根据形态学的差别重新界定为二种：Giardia硎凰(两栖动物)，Giardiaduodenalis(哺乳类、鸟类、啮齿动物)，随着精细的超微结构形态学方法的出现，其他种类跟着山现：在小尾鹦鹉寄生的Giardiapsittaci"圳， 河南农业人学博上学位论文第一章文献综述苍鹭中寄生的Gi口心矗口口，沈臼P1391，和寄生丁麝鼠和田鼠的G，口，胁amicroti[40l；而且随着宿主检商数量的增加，像隐孢子虫一样可能会有新的种类得以鉴别和确定，特别是对丁．以前描述过的种类【4“。Gduodenalis是从人分离到的贾第虫种类。甲．期采川多种分子T具对人分离物的研究表明在Gduodenalis内存在基闪多样十牛。弧群的描述被分为Nash群1，2和3及Andrews群l，ll，111andIV142441。这些弧群与·Assemblages’A1年IIAII及BWI／BW相对应[45,46l。贾第虫士要种类和G砒fDde”口凰见表1．21471。其中聚集体Al主要感染人，也有感染动物的报道，是人兽共患型；聚集体All也是人兽共患，儿聚集体BIII，人兽共患掣；聚集体BIV以人感染为上，动物也可感染。最近对贾第虫的研究多是针对野生动物羽I多种家留中的Gduodenalis基冈砰9的举定，搽定的主要基冈l_包括从人分离剑的聚集体A_；flIB，及新的宿主特异性基冈型和现住特定的往犬感染的聚集体Cg[D[,17,491：在有蹄类的家畲上寄生的聚集体ElSOl：住猫体寄生的聚集体F⋯，以及从鼠类寄生的聚集体G【521。聚集体Gdz州le"“lh，虽然从形态上进行鉴定平¨描述，但是人越的基冈差异表明Gduodenalis凡有物种的复；5j性[43,45,51】。表1．2主要贾第虫种类和(j砌odenffm的基因型Table1—2SpeciesofGiardiaandassemblagesot’(2duodena／『is2．2贾第虫的基因分型贾第虫基冈主要采川贾第虫特异性的、61duodenalis特异性、聚集体特异性基冈位点，如小弧基rDNA(SSUrRNA)、VPS基冈(variablesurfaceprotein)，GDH基冈(glutamatedehydrogenase)，TPI基冈(triosephosphateisomerase)，ELFA(elongationfactor1alpha)，D贾第素基冈(betagiardin)等。采1l=}』的方法有直接PcR电泳检夯产物火小的多态性，和限制6 河南农业大学博：Ij学位论文第一章义献综述性酶切片段多态·陛--RFLP或者直接测序米比较分析145-48,53-57】。分子流行病学研究已经做了很多新的分离物来进行研究，也发现了发现贾第虫的人兽共患传播[41,58,59J。这些方法在贾第虫诊断、分类、分子流行病学和种系发育分析方面的都有不同的戍JLfj|价值。3．主要哺乳动物隐孢子虫流行情况目前公认的隐孢予虫有效种为24个，基网g'-170多个，人体感染的虫种有10个，基冈巧4有6个，其中(Zhominis，C．parvum，是感染人的最常见种，(imeleagridis，Cfe凰，Ccanis，C．ubiquitum，C．suis，C．muristCandel‘soni，C，Jayeri，skunkgenotype，chipmunkgenotypel，horsegenotype和piggenotypeII基冈犁已经确认为人兽共患种类|l-271。而这些人兽共患种类最受人们的重视，也是研究的热点，卜面就与人关系密切的家养动物隐孢子的流行情况做一综述。3．I牛隐孢子虫日前认为牛是C．parvum的白然感染宿主，也是人感染隐孢子虫的土要传染源。对牛隐孢子虫的研究较多，不管是奶牛还是肉牛，，0-6个月龄牛的隐孢f虫和』贾第虫感染率较成年牛高。自然感染隐孢子虫牛的最小日龄为一周龄，牛白然感染贾第虫的多在4—7周龄1601o考虑剑这些宿主作为主要的人兽共患种类／基冈疆u的储存者，更多的研究把注意力放在牛尤其犊牛上：前_}{I]研究发现C．parvum山现丁．1—3周龄的犊牛，随着日龄增加依次⋯现的是e60v括和eryanae(原称thedeer·likegenotype)。Candersoni上要感染往8个月龄以上的牛旧“。感染牛只每大可以向外排山数以白万计的卵囊。国内Wang(下荣军)等【6副(2011)对我省七个地区八个奶牛场的断奶前犊牛的801份粪样检测，发现隐孢子虫感染率为21．5％，最高感染率为40％，基丁SSUrRNA的PCR—RFLP币¨gp60分析，共发现四种隐孢子虫，C．paJ_l，1tJ77(54／I72)，(160v括(65／172)，(T．ryanae(19／172)，祠IC．andersoni(12／172)。在1周龄的牛检测剑(『_bovLY。感染C．porvum高d{辇出现在夏季，而(ibovis土要在秋季和冬季山现。CpaJ‘yllm和(1bov#感染无年龄筹异。gp60弧型分析发现67个C．parvum都属丁弧型lldAl9G1。Liu等(2009)【62J对黑龙江省的八个奶牛场507份样品初步显微镜检商斤，卧I生样品经SSUrrRNA，actin，HSP70基冈检测发现，米臼5个奶牛场的27份样品分属丁Candersoni(26／27)、C．ryanae，这个结果与世界上其他地区牛隐孢子虫种类分布不同。3．2猪隐孢子虫Ryan等(2004)p列首先通过形态、生物学特性、多基冈位点方法鉴定并命名了猪隐孢子虫C．suis。此前，Atwill等(1997)164】对野猪的粪样进行免疫荧光法检夯，发现分别有j2(5．4％)头和17(7．6％)头野猪有Cparvum卵囊和贾第虫包囊排出。尤其以幼龄猪和饲养密度较人的猪排出卵囊更多。Xiao等(2006)[651对米白爱尔兰33个猪场的56只猪的样品进行DNAPCR检测发现25份剐性样品，发现C．suis，Cryptosporidiumpiggenotype11，和C．muris儿种类型。Wang(干荣军)等(2010)[661对河南省猪隐孢子虫流行病学调奇发7 河南农业大学博Ij学位论文第一章文献综述现，Csuis为猪隐孢子虫优势种类；除了3-6月龄猪朱发现隐孢子虫感染外，其它各年龄群的猪均鉴定出2个种类／基冈型(C．suis,jpiggenotypeII)；csu&更常见丁．幼龄猪，而在人丁．6月龄猪中，piggenotypeII比C．suis相对常』JI!．。剑目前为I卜，在猪体内共鉴定山7个隐孢子虫种类／基冈型，包括(iparvum，(_yz出，(T_i17ZtriS，piggenotype11。C．andersoni，(?hominis利rnoHsegenotype1。住这些种类／基冈7弘中，(is“曲和piggenotypeII为猪体寄生的2个最为常见的种类／基冈型。3．3绵羊和山羊的隐孢子虫千的隐孢子虫与人隐孢子虫虫病之间的关系目前尚无定论。有人认为这些动物小是重要的人兽共患病原的贮存宿土167．681。最近有址据表明绵羊和th羊是某些有人兽共患风险种类或者是基冈型的贮存者169,70]。整体上讲，绵!F种群庞人，2006年全球估计数鼍住11亿多只17”，山口和内销两方面衡量，主要的养殖人围是中国，澳人利弧，印度乖『伊朗，发展中国家If．全球养殖总鼙的60％，欧洲最人的绵羊养殖国家是英国。绵羊利山羊的隐孢子虫流行病学洞商资料中，很多报道没有进行遗传特性方面的研究，缺少是否具有潜在人兽共患的鉴定信息。现有的资料和表明，绵羊隐孢子虫的感染率从5％一70％。对山羊的隐孢r虫研究相对较少，感染率从5％．35％。绵羊隐孢子虫的种类平¨基冈，¨以(’．p吖Ⅲ棚平llcervinegenotype(现己命名))JCubiquitum)为主，米白澳人利弧、比利时、捷克、葡萄牙、阳纠f爿：、英国、关国、赞比亚和中国的报道，发现67％的C．p甜Vlfl?l，23％的(1．ubiquitzon干¨5％的(T‘f)臼v如，其他的种类包括Candersoni，(ihominis，cfayerii，Cs“越，(’ubiquitum)砭)L个未定基冈型阻7引。cervinegenotype年ll(T_ubiquitum在加拿人、新I北i兰、斯洛文尼弧、英国的报道中人也有感染㈣，这表明午是人隐孢r-虫病的滞住传染源。国内Wang(千永立)等(20i0)IHl对河南省四个地区5个羊场的1701份粪便样品检布共发现隐孢子卧I生样品82份，经SSUrRNAII{JRFLP分析年llgp60基冈序列分忻，鉴定了二种隐孢子虫种类，Cryptosporidiumcervinegenotypef74／82)、Candersoni(4／82)、C．xiaoif4／82)。C．ubiquitum在各种年龄绵羊均有发现，(1xiaoi、(?andersoni分别在羔羊和母羊中流行。在C．ubiquitum和C，xiaoi中，同种样品序列问没有基冈筹异。两个基冈何点的扩增都没有发现Cparvwn，结果表明绵羊是人兽共患隐孢子虫Cubiquitum的滞在感染源。此外，研究表明，绵羊隐孢子虫流行虫种有地域筹异，欧洲主要是Cpwwum，其它地方以c．ubiquitum为主，在澳人利踮60个样品中没有一个分离剑c．parvum。虽然C．parvum是公认的人兽共患种类，C．ubiquitum是潜在的病原，这个基冈型地域分布较广，宿t范同也很宽泛，不仅仅在绵羊和鹿发现，在捕获的灵K类、动物旧的向斑羚，和人的感染。表明这个基冈型可以在人与动物间传播12"。照此推测，米白绵羊约90％的隐孢子虫分离物会直接或通过污染环境而传播给人类。但就目前为I卜，还没有发现由Ji绵羊或山羊隐孢子虫或贾第虫感染而导致接触人群发病的报道。 河南农业大学博二卜学位论文第一章文献综述3．4马属动物隐孢子虫马属动物隐孢子虫病的报道研究主要在波兰、意人利、美国、德国、英国等国家【75-8纠。马隐孢子虫寄生部位为小肠，常引起马驹的腹泻，在成年马则表现为无症状感染。马发生隐孢子虫感染的附I生率从O．27．87％不等，对马驹和幼龄马感染率较高‘75,8,1,89]，而成年动物相应较低。其传播途径被认为母马问歇向外排虫，对应马驹感染斤利其他马驹冈为共享活动场地或罔舍而更易J：在马驹中流行。马属动物感染的主要种类是C．parvum，horsegenotype，以及Cparvumbovinegenotype(即现在的Cboris)[79-80}这儿个种类中人兽共患种类为是(1．parvum，horsegenotype。其中Majewska的报道[82-84】发现C．parvum主要米白成年马的粪便样品，感染的马匹没有临床症状，刚性样品卵囊数蟥很低。马属动物隐孢子虫流行病学调布中，也有骑手感染的报道Ⅲ“。卜表l一3列出了最近儿年米报道的关丁马属动物隐孢子虫的研究。表l一3马属动物隐孢子虫病及分子流行病学情况Table1-3EquineCryptosporidiosisandMolecularepidemiologyofCryptosporidium9 河南农业人学博士学位论文第一章文献综述3．5犬隐孢子虫目前有很多针对犬的隐孢子虫流行病学研究‘2’1’90。1031，在我国犬隐孢子虫总感染率为2．59％(29／770)193l。这个和美m(2．O％和3．8％)194-951、意人利(3．3％)190l及日本的比较接近f3．9％、[961。多数犬隐孢子虫感染不显示临床症状，以幼龄犬易感，感染率有随年龄增【丈而降低的趋势m96971。犬的隐孢子虫感染没有性另0筹异陋991。犬隐孢子虫种类和基冈型研究发现，犬感染隐孢f虫的优势种是(1．canis。我国犬的隐孢子虫t要流行种类为c．canis(本试验室待发表资利)。这个种类在1廿：界范罔内犬隐孢r虫中最常1见196,100-105l，而该种往英国，牙买加，占尼弧，秘鲁，泰国币¨美国等地少数人病例中发现11．1031。冈此C．canis现在也被认为是人兽』L患种类，闪为在有免疫能力和免疫力低p的人中均发现．厂该种[44,89,104-106]。还发现少数犬感染c’pwPll”7，(1111111·is，丰¨cmeleag#·idis这些公认的人兽共患隐孢子虫种类o。0。5-107-1”1。3．6兔隐孢子虫兔隐孢子虫感染1F常普遍：澳人利弧、日本、英同等同家的肉兔、实验兔、野兔和宠物兔中均发现隐孢子虫感染，感染率为o．o％一32．4％I“}⋯l。国内河南、青海、徐州、延边地区分别为3．4％、5．1％、5．56％、65．8％。人感染病例近年米时自‘报道：尼日利弧儿童[108J、英国免疫J卜常成人⋯51、英格兰尔部水源性暴发人的兔隐孢子虫病11161、法国艾滋病人感染⋯7l等。有关报道或米白GenBank信息见表1—4。‘7．期报道的白然感染兔隐孢子虫均未进jJ：分子遗传特ajj分析，不能准确的鉴定剑种／基冈丌!。Chalmers等(2009)⋯71基丁gp60基冈不同分将它为2个、IF珥!家旅Va平¨Vb，国内兔隐孢r虫分f特征分析仅见丁本试验室研究生KeShi(史¨)等(2010)Il,81的报道基丁SSUrRNA，actin，COWP，hsp70，gp605个基冈何点对37个分离株进行研究，共发现VbA36、VbA35和VbA293个基冈弧型，而不同兔种类和年龄段亚矸9分布不同。Bouzid等⋯叫基丁十个新基冈何点对C．hominis平¨C．parvum等配对组合方式(pair-wisemanner)比较两个种4洋间单核茁酸多态性筹异时发现C．hominis和C．cuniculus基冈变异筹异较小。此外，Robinson等‘29I刖SSrRNA、HSP70、actin、COWP、GP60荩W分啊9】：具也发现两者在进化树处Ji较近的分支上。目前发现感染人的病原多为Va弧7弘家族(见表1—4)，而兔源隐孢子虫属丁Vb家族，该基冈型是否为人兽共患尚需要进一步研究。4．主要哺乳动物贾第虫流行情况贾第虫在不同动物中流行情况不同，同时，根据与人关系密切科度，其流行情况受关注的程度也不相同，各种家养动物贾第虫流行情况也各不相同。4．1牛的贾第虫牛贾第虫最常见的种类是1F人兽)L患的聚集体E1121-1221示i1人兽共患的聚集体A。贾第虫在舍饲牛群中的感染率为2％．59％【|22川241，在放牧牛群中流行率为50％．71％[122,126-1281o0 河南农业人学博Jj学位论文第一章文献综述贾第虫聚集体B在牛中也偶有检出1m】。Langkjaer等{130l对50个牛群1150份牛的粪便样晶件j免疫荧光法进行检奇贾第虫和隐孢子虫，145份样品护‘增了贾第虫18SrDNA；乖IIGDH基冈，在犊牛和成年牛都发现了人兽共患的AssembIageA，而母牛中只发现了AssemblageE。表1．4目前已报道或GenBank上查到的fcltnicu[1ts人感染病例及其分型7FableI-4lhecaseofhumaninfecteds、ith(ierOTiC。u／usfrompreviousreportsorGenBank4．2猪贾第虫50个猪群1237份猪粪便样品川免接荧光法检布贾第虫利隐孢子虫，含卵囊／包囊的较多的样晶州丁序列扩增测序和系统发育分忻。征183头猪样，}i|1扩增山(iJ砒’，piggenotypeIf’Cparvum，不管是猪还是牛，贾第虫种类羊¨基冈聚的分布随宿主年龄增加发牛变化。断奶仔猪和小猪在内的82份样品仃人兽共患的AssemblageA1130l。4．3绵羊和山羊贾第虫绵羊和山羊是世界性分布的家眚，但很少有关丁这两种动物对当地人寄生虫感染造成影响的报道。和隐孢子虫流行情况一样，现有的资料中，关丁羊贾第虫分子生物学信息较少。贾第虫对绵羊的感染率从10％．40％㈣】，羔羊有较高的感染率平¨感染强度。对山羊的li．rF究更少，文献报道发现绵羊或山羊贾第虫的最常见基冈型为聚集体E，lII总调商数的75％，聚集体AIll27％，聚集体Blll2％Im。331。有些动物为j昆合基冈型感染。绵羊的贾第虫估计有30％的是人兽共患的种类，存在直接或通过污染环境传给人的潜在危险。4．4马贾第虫文献报道马属动物的贾第虫流行在各地感染率从0．25％1134-1351。Atwill等(2000)报道m6】美国国家森林公同305匹驮马和骡贾第虫感染率为4．6％，Traub等【137】扶纽约州lo匹马剐澳 河南农业大学博士学位论文第一章文献综述人利Ⅱ西部的2匹马中分离到贾第虫，经SSU．rDNA分析，有8个属丁聚集体B，3个属丁．聚集体A，1个属于聚集体E；TPI基冈分析发现，3个属丁．聚集体AI弧型，另外两个属丁．聚集体AIlⅡ巧!。TPI基冈系统发育分析发现，米白纽约州的4匹马的分离物属丁宿主特异性弧喇Blv。上述发现表明马可以作为人感染贾第虫的满在感染源。Butty(2011)U381对伊拉克的107份马的样品检奄发现隐孢子虫和贾第虫总感染率为27．10％和19．63％，但是没有做遗传特征鉴定。表1．5家畜中贾第虫的感染率和基因型⋯8—149Tablel一5GiardiaduodenalisintEctionr31esand8enotypeinanimals4．5犬贾第虫火感染贾第虫的主要基冈型是聚集体C和D，最近文献报道聚集体A也有较高的感染率，而聚集体B住犬中偶有发现。住聚集体A中，卞要的Ⅱ犁为Al矸9，而AII则较少址，但也不是绝对的，住ClaereboutI”91的研究巾就发现AII弧孤9是主要Ⅱ型。Traub等(2004)【1401对印度北部同一个茶场的犬利人贾第虫感染情况进行了分子鉴定，经TPI基冈序列洲序比对，发现人和犬分离株均属丁_集聚体A平¨集聚体B，在同一住所中，人贸第虫感染率荆I犬贾第虫感染早】阱日关性。lnpankaew(2007)【⋯】对曼谷204份人、229份犬粪便检查分析发现，人感染的贾第虫基洲型为集聚体A和B，13份犬贾第虫以集聚体A为优势虫种，其次是集聚体D、B和C。这表明犬在人贾第虫感染中可能有重要的意义。4．6猫的贾第虫猫的贾第虫主要是聚集体A并IIF，聚集体F是常见基冈型。聚集体A的主要弧型是AI，AII平IIAIII也有报道。2011年在日本尔京进行的猫贾第虫感染凋商具自11_℃表性1142]o米白16个猫caf6sJ占、31个宠物J占和东京动物看护利咨洵中心的32】份猫粪便样品检测发现上述三种场12 河南农业大学博士学位论文第一章文献综述所猫贾第虫感染率分别为19．1％(22／115)，1．2％0／85)年H2．5％(31121)。对其中的26个样品进表1．6贾第虫在发达国家和发展中国家人的感染率和基因型[148—149JTablel一6Giardiaduodenafisint’ectionratesandgenotypeinhumansindevelopedanddevelopingcountries行遗传特征分析发现，米白两个猫caf6sJ一的6个样^^属丁1人兽共患的assemblageAl、20个米13 jlII南农业大学博士学位论文第一章文献综述白其他地方的样品属于assemblageF。根据GDH基冈，6个样鼎同属1：一个组，而根据TPI基冈，其中的两个义1j其他4个属丁．不同的族群。在猫cafes店的猫中分离到人兽共患的贾第虫种类，提示人们要防范猫传播贾第虫病的风险。4．7兔贾第虫在世界范同O．J，兔贾第虫的报道很少，现有的贾第虫分子分啊!结果都是聚集体B114斗14钔。国tZJZhang等(2012)It451报道我国黑龙江省兔的贾第虫经TPI摹冈鉴定，分属丁聚集体B型的BI至Bill的8个不同弧型。也有川兔人I：感染人游贤第虫的报道1t461，以及从家兔分离到贾第虫并建立了纯培养方法114”，各种家留感染的贾第虫种类利基冈型见表1—5。4．8人感染的贾第虫种类人感染贾第虫以聚集体A币IIB为主，分圳¨I总感染率的39．4％羽157．3％，A、B；}|i合感染lIi总感染人数的3．4％，其他基冈型感染病例比较少儿。详细地表1—6。5结语随着分子生物学技术普遍廊刚和人．It‘J对隐孢r虫平¨贾第虫病的重视，人和动物隐孢子虫剐贾第虫种类、生物学特性的研究会逐步深入，人兽间隐孢，虫利贾第虫的相互关系和传播途径会更加清楚，这将有助r对隐孢，虫病、贾第虫病的有效防控。4 河南农业大学博上学位论文第一二章马属动物肠道寄生虫隐孢予流行病学调查第二章马属动物肠道寄生虫流行病学调查1引言在常见的家畜中，包括马、驴、骡在内的马属动物是我国饲养历史悠久的主要家备之一。驴起源丁th'a'11，讣洲野驴为现代家驴的Ii-rl先。据研究，中国在公元前4000年左右殷商铜器时代，新疆莎午一带已开始驯养驴，随后由阳北进入陕曲、H肃及中原内地，作役备使JL}j。随着生产力的发展，马属动物作为役使的使命逐渐减弱。但是随着人们生活水平的提高，食驴肉之风也在J’‘尔、J、‘柏、陕坩、北京、人泮、河北、山尔等地兴起。驴皮质柔韧厚实，可川丁|制革，并且具有药川价值，是名贵中药“阿胶”的原料。养驴业本身就是传统寄牧、Ik的一个细成部分，在_fj’些地区的农村特别是山区、、lq山区、匠陵地区驴是短途运输、驮货、耕田、磨米面的等不可缺少的牲备。冈此，功、的养殖量在华北一带仍然很多，卡要分布往河南、河北、山尔、内蒙、甘肃、山阳等地，养殖模式主要以农村散养为主，目前逐渐自．集约化养殖场山现，不过规模和动物来源仍成问题：养殖的动物多、卜是从农户手中收购，然后集中养殖育肥、山售。冈此同一养殖场里驴的品种和米源比较复杂，寄生虫病等的流行／1i可避免。国外如埃塞俄比弧【m小11、苏丹I眦】、伊朗‘mI、十耳其‘Ⅲ】、南1叫551等对驴寄生虫的调奄主要足危害火的蠕虫或消化道寄生虫，Pavlasek等(1996)I。56J首先报道了捷克马的贾第虫，Bully等(2011)Il”I对伊拉克马隐孢子虫平¨贾第虫流行情况进行了显微镜检。我国对马属动物的寄生虫流行病学调布报道有：周婉丽1158J对四川马属动物寄生虫调布利曹伊凡等1i$9]对曲藏的野生驴粪便检布，卜艳珍等(2010)1i60l对河南儿个地区驴的体内寄生圆线虫进行调查，干时伟等(2012)[t6t1对新疆新疆叶城县驴胃肠道寄生虫感染情况凋奄，钱德兴1163】张赫凡等Il∞J都发现马感染多种寄生虫，但至今没有见驴隐孢子虫、贾第虫流行病学报道。隐孢厂虫是常见的寄生性原虫，它可以引起动物以胺泻为主的隐孢子虫病，在很多家养动物中，如牛、羊、猪、兔、犬、猫及禽类中均有寄生。有些动物中所携带的隐孢子虫属丁．人兽共患种类，可以通过直接接触或污染水源、蔬菜水果等间接传播给人类，虽然隐孢子虫已经引起人们足够的重视，对隐孢子虫动物源传播情况有很多尚不明晰之处。比如在我国，已经进行了人，牛，羊，猪，兔，鼠，鸡，鹌鹑，鸵鸟，猴，貂，骆驼，梅花鹿等动物隐孢子虫流行病学调杏与分析，发现了动物源的隐孢子虫人兽共患种类或基因犁Cparvum，cubiquitum，Cryptosporidiummeleagridis等。为探讨我国马属动物，特别是驴的肠道寄生虫尤其隐孢子虫、贾第虫流行情况，从2008年8月至2010年11月对我国马属动物养殖比较集中的河南、山东、甘肃、内蒙古等地的马属动物进行』，肠道寄生虫流行病学调查。 河南农业大学博一L学位论文第二章马属动物肠道寄生虫隐孢子流行病学调查2材料与方法2．1样品来源2008年至2011年期间，在河南、山尔、内蒙古、甘肃，河北、四川等省份共采集马属动物粪便样品1302份，其巾驴1043份、马209份、骡50份。标记粪便样品所对应动物的性别、年龄、健康状况等相关信息，粪便样品置4。C冰箱中待检。2．2试齐0配肯0饱和蔗糖溶液(比重1．28)：蔗糖5009，蒸馏水320mL，加热并搅拌至蔗糖完全溶m罕后加入苯酚7mL保存备HJ。卢戈氏碘液：碘化钾49，碘29，蒸馏水100mL，i容解完全斤备州。2．3显微镜检测饱和蔗糖溶液漂浮法：取被检粪便109，加蒸馏水搅拌均匀后经80日粪筛过滤至50raL离心管中，3500r·rain。离心5min，倾倒上浩液，_L}j一次性筷子把粪便沉淀物搅匀后加入35mL饱利蔗糖溶液，阿搅拌均匀斤3500r·rain“离心5min，川吊环蘸取表面液膜r一洁净载玻片上，加盖盖玻片斤置显微镜检夯。卢戈氏碘液染色法：取载玻片分别对应粪便样品进行编号，然后在载玻片上i商)JH卢戈氏碘液，_L}J适量粪便样品涂丁．载玻片上并与卢戈氏碘液；昆匀，最后盖上盖玻片待检。每个样品显微镜检布时观察20个视野，发现寄生虫卵／卵囊／包囊jJjl记为刚性，发现疑似包囊记为可疑。3．结果3．1马属动物肠道寄生虫流行概况本次调查共采集河南沁⋯牲备交易市场，泌⋯驴保种场，山尔嘉祥集约养殖场等处的驴或马等粪便样品共1302份，发现马属动物肠道寄生虫感染主要种类为划线虫、球虫、蛔虫、隐孢子虫。其中感染球虫的118份，¨I采样总数的8．83％，隐孢子虫ISlf性平¨疑似附|生222份，III总样品数的17．5％；圆线虫的感染率最高，发现I；Il性样品729份，¨I总数的55．99％；蛔虫附|生样品为164份，lII】2．60％；绦虫相对较少，共发现46份附肚，HI3．53％：其他如贾第虫，纤毛虫和毛滴虫等共49份，¨I3．76％。其L卜I划线虫虫g口的EPG最高可达2200个。详细结果见表2一】，查到的部分寄生虫的虫卵或卯囊地图2—1至幽2—8。隐孢子虫阿1性或疑似|j¨性总计222份，从显微镜检结果看，隐孢子虫在马属动物rfl的感染强度很低，附陛样．Wl的感染强度在蔗糖漂浮浓集斤观察20个视野，平均每个视野也就是l-2个，有的样品20个视野只能石‘剑2-3个，感染强度比较低。从卵囊形态看，马属动物的隐孢子虫属于小型卵囊，近圆形，人小在5um左右，由丁单个粪便样品的隐孢子虫数量均少丁50个，没有进行卵囊的人小测定和卯囊指数的计算。6 河南农业大学博士学位论文第一二章马属动物肠道寄生虫隐孢予流行病学调查图2-1圆线虫卵(400×)FI譬2一IEBgof斯"on册'le400x图2-2马副蛔虫卵(400×)Fie2-2E￡esofPdI'OSC(II’iseIH／o／+11111400>(图2-4钩虫卵(400×)Fl￡2—4Eggof．hookll’01711400“图2—5未孢子化的马球虫卵囊(400×)图2～6孢子化的球虫9p囊(400×)Fi82．5Unsporulaled肋MidleucartioocysI400×Fi92·6sporulatedEj⋯’o，⋯刚’00cYst400x图2—7隐孢子虫卵囊(400×)17图2-8已孵化幼虫的卵(400×)Fi92·8Incubatedlarvaeinegg400x 河南农业大学博一L学位论文第二章马属动物肠道寄生虫隐孢予流行病学调查图2-9本研究中采样点分布Figure2-8ThedistributionofsamplingsitesinChinainthisstud)’3．2马属动物肠道寄生虫混合感染情况不同米源的马属动物肠道寄生虫的|j|1．|生率在3I．94％．100％之间，总同l性率为70．74％，混合感染率从O-70％不等，内蒙占军马场的军马感染率最低为31．94％，混合感染率为2．08％。各采样点附l生率利混合感染情况见表2-2。3．3不同种类、年龄的马属动物肠道寄生虫感染情况本次凋布共采集驴粪样1043份，马(包括斑马)粪样209份，骡50份，马、驴、骡隐孢子虫刚性加疑似刚性率分别为19．71％，7．17％，2．00％，球虫⋯性率分别为9．97％，3．82％和6．00％；线虫的⋯性率为65．12％，21．05％，18．00％。三种马属动物中，骡的线虫和隐孢子虫的感染率较低。调查发现不同年龄组马属动物的寄生虫感染情况不同。人月龄及其以下组、6-12月龄组、成年组隐孢子虫附}生及疑似ffll性率分别为29．21％、38％、8．42％；三组马属动物线虫的⋯感染率分别为86．14％、84％、36．14％，二组球虫感染率分别为9．17％、10％，8．55％。可见，在三种寄生虫感染中，一周岁以．卜．的马属动物往隐孢子虫、球虫和线虫的感染率相似，成年动物较低。结果见表2．4。18 河南农业大学博士学位论文第一二章马属动物肠道寄生虫隐孢子流行病学调查表2．1马属动物肠道寄生虫检出情况Table2—1TheResul{ofintestinalparasitesdetection19 河南农业人学博一i：学位论文第二章马属动物肠道寄生虫隐孢予流行病学调查表2．2马属动物肠道寄生虫混合感染情况采样地点采样数阳性份数tl；N·m禾(％)混合感染份数／混合感染牢阴性份数SamplingsiteNo．ofSamplesNo．ofpositivelrateNo．ofco-infection／rate(％)No．ofnegative3．4不同饲养模式下马属动物肠道寄生虫感染情况对不同来源样品的统计分析发现，不同养殖模式r或者是不同生活环境中，马属动物的寄生虫流行情况筹别显菥。往集中养殖方式卜，马属动物任球虫、隐孢子虫、蛔虫、绦虫的感染率分别为8．83％、21．03％、19．77％、5．24％，高丁农,H平II在交易市场山售的散养驴(分别为4．02％、12．93％、0．86％、1．14％)。娱乐场所的马或功、肠道寄生虫感染率较军马高。而圆线虫的感染率往散养、集中养殖、娱乐场所方式卜摹本持半，在56．25％一60_45％中间，军马的圆线虫感染率为21．53％，是四种模式卜最低的。军马平¨散养驴／马的蛔虫的感染率接近分别在0．69％$11O．86％，娱乐场所和集约养殖的驴／马感染率在18．75％平1119．77％。在娱乐场所和军马中没有发现球虫、隐孢『‘虫以外的其他肠道原虫寄生。详细结果见表2-5。20 河南农业大学博：l：学位论文第二章马属动物肠道寄生虫隐孢予流行病学调查嘲◆跏图2．10马属动物肠道寄生虫混合感染情况其中1．19分别对应表1．2的采样点；系列l为采样总数，系列2为阳性数，系列3为混合感染数Figure2-9MixedinfectionstatusofequineintestinalparasitesNo．1—19Correspondingtosamplingsiteoftable2—2；linel，No．ofSamples；line2，No．ofpositivesamples；line3，No．ofCO—infectionsamples表2—3不同动物种类肠道寄生虫感染率Table2-3Theinl’ectionrateot’intestinalparasitesofdiflkrentanimalspecies3．5不同季节马属动物肠道寄生虫感染情况本次调夯对同一采样地点的夏季(7、8、9月份)利冬季(12、2月份)采样检测结果表明，肠道原虫中的球虫、隐孢子虫夏季比冬季的感染率高，而圆线虫的刚性率则无显著的季一1，变化。对泌刚驴保种场的驴粪样的检测发现，蛔虫在2月份感染率较低(2．33％)，在7月份达到19．57％，八月份义降为5．88％。沁刚市场交易动物冈为米自不同的地区和饲养模式，蛔虫的感染率无季‘1，性。详细见表2-6。2ll；篓瑚翟鼍。 河南农业人学博J：学位论文第二章马属动物肠道寄生虫隐孢了．流行病学测壹4．讨论4．1马属动物肠道寄生虫感染马属动物的寄生虫感染1F常普遍，寄生虫感染的优势虫种是圆线虫。本次调夯对我国华北华东儿个省区乖J四川省的雅安及阿划地区的故养马和驴采样调查，发现马属动物肠道寄生虫的感染率为70．74％，利千时伟(2012)I|611阔布结果(100％)、埃塞俄比弧的感染率(70％一】00％)相似1150Ⅲ1I。钱德兴报道(1995)『㈨1马圆线虫的感染率分别为45．78％，较本次结果低。蛔虫总感染率为12．6％，比国it周婉丽(1990)1i581对四川马属动物的(22．5％)和新疆II{_城县驴感染率(16．7％)低，与其埃塞俄L-k_,qP．5％I”们、苏丹lO．7％[152]、伊刚20％ll531、十耳其9．8％11-441和钱德兴[162l检测结果(11．38％)相似。此次调商圆线虫的感染率55．90％，而四JIl马寄生虫凋布中发现仅马蚓线虫的感染率在马、驴、骡就分别为70％，14．29％，100％。无齿侧线虫住马的感染率为85．8％，驴57．14％，骡100％。普通圆线虫|I!IJ分别为92．5％，85．7I％币¨100％。曹伊凡(2006)l”91对曲藏野驴的类样检商中发现圆线虫卯，感染率为100％，感染强度EPG值为104，虽然感染强度较低，而感染率高丁本次凋奈结果。表2-4不同年龄组动物肠道寄生虫感染率Table2·4Theinfectionraleof~inteslin,nlparasitesofanimalswithdifferentage动物年龄采样数隐孢子虫阳性数／率球虫阳性数／率线虫阳性数／率AgeofNo．ofPosili～enumber／riteofPositi，enumberPosill、e¨un】brranimalsamplingCO'pto．'poridimn／rateofCocddinm／rateofNematoIIc～一———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一<6门龄46937／292I％43197％404／8614％6．12月9／38％5／10％42／84％成年78366／8．42％67／855％283／364表2—5不同饲养环境下马属动物的肠道寄生虫感染情况Table2-5lnfi!ctionrateofintestinalparasitesofEquineindiltixentfeedingenvironment饲养环境采样总数肠道奇生虫感染情况feedingNo，samplesenvlrOnmentnfeclionrateofintestinalparasites球虫隐他了虫网线虫蛔虫绦虫CocddiumCryptoq，or#liumSt#of7DlePor03ccais("estode散养／交易市场348集中养硝794娱乐场所军马16144eqltot。f，，”je他0therSpecie4／4．02％45／12．93％209161705％3f0．86％4／1．14％I／029％70／8+82％I67／203％48016045I57／l97742／524％4816．05％／6’25％2，12．5％8／5，56％8／5．56％9／56．253／18．75％03l／21．53％I／0．69％O0 河南农业大学博二I-：学位论文笫_二章马属动物肠道寄生虫隐孢了流行病学调查表2-6同一采样点不同季节马属动物肠道寄生虫的检出情况Table2-6Thedetectionrateofparasitesinsamesiteofequus本次调夯马属动物球虫总感染率往8．83％，仅次丁线虫的感染率。不同种动物感染率有筹}；0，本次凋布的马感染率为3．82％，驴为9．97％，骡6．00％。而Sotiraki(1997)11641对希腊马属动物寄生虫凋布时报道的二种动物的感染率著别更人：骑川马的球虫感染率3．4％，农川马的为1．3％，驴的球虫感染率8．1％，而骡的感染率为89．3％。本次调布的马属动物绦虫的感染率为3．53％，与钱德兴(1995)ll621对马属动物的寄生报道(3．49％)相近：周的报道中，裸头利绦虫的对二种动物的感染率从5．％剑32．5％不等，和本次调奄的3．53％相比，也较高。阢止样等116j1(2005)对黔尚马寄生虫剖检绦虫2种．1If4．88％，强度在2--3条之间：线虫34种，lII8293％，强度住1．1833条之间：和本次的凋商结果相近。马属寄生虫感染较为普遍，究其原冈，与农l心的饲养管理方式和地理生态环境密切相关，敬养驴与其他家养多种牲寄混养，给许多寄十虫的感染和传橘造成了有利的机会，集约化养殖密度过人，在马、驴活畜交易iH场售卖的过程中，人鼙动物挤在狭小的场地中，粪便不能及时清理，也为寄生虫的相互传橘提供了便利条仆。4．2马属动物隐孢子虫感染情况最早的马属动物隐孢子虫是在五匹免疫抑制阿拉伯马驹发现的，国外马属动物隐孢子刚性率从0．33％．27．87％之间11661，也有1％．47％的感染率报道。而Mirian等201011671对伊朗德黑兰马的隐孢了榆查发现报道总阳性率为25％，在春夏秋冬季节的感染率分别为25％，50％，7％和3％。Butty等(2011)㈤81对伊拉克的107份马的粪便样品州漂浮法检夯隐孢子发现其同『性率7,n7．10％(29／107)，贾第虫的感染率为19．63％(21／107)。Olson(1997)等‘⋯1对加拿人15个不同地域的农场的家葺隐孢子虫和贾第虫流行情况进行调查，发现米R4匹马粪样采样点贾第虫的感染率为20％，隐孢子虫的感染率为17％。Forde等【1691对美国科罗拉多，1 河南农业大学博J二学位论文第一章马属动物肠道寄生虫隐孢了流行病学训金』，11300匹娱乐用马进行了隐孢子虫和贾第虫检测，发现仅有1匹马隐孢丫虫刚性(0．33％)，2匹马贾第虫⋯性(0．66％)。已经报道的粪便检测方法主要以商品化的免疫荧光，ELISA方法及抗酸染色和PCR检测等[83-87]，这些方法相对本次试验J{j的饱平¨蔗糖溶液漂浮法检测特异性妤，一股不会出现假刚性。本次调布中，发现样r铺虽经饱和蔗糖溶液漂浮法浓集，可看到的隐孢子虫数蕈依然较少，其原冈可能是所采样-铺多数为成年动物，免疫力良女r，隐孢子虫的虫荷数较低，仅甲带虫状态。有时对一个样品观察至少20个视野才能发现3-5个卵囊，近1／3的样品只肴剑一个或两个玫瑰红色的小型虫体，内部结构小易观察，这种情况我们在此视为疑似样品，有些可能为环境真菌的孢子，为防I卜=渊检，也为卜．一步进i71急孢子虫分子流行病学悯布提供更多的待检样品，住进行本次调布的感染率统计叫，将疑似样r铺计算在⋯性样．锦内，一并进入卜一步试验。冈此，本次泪布隐孢f虫镜榆初筛的fj『|性率高丁-实际感染率。本次采样点涉及河南、山尔、四JII、H肃、内蒙占等省市fl治|又：，从地域上讲，这些省市是土要的养驴产区，其中是沁刚“豫北毛驴交易,Is场”基本形成了“买全国、史全国”格局，被农业部认定为全国唯一的“毛驴交易定点市场“，该市场单口交易量最高达剑580头，且交易的-51。1骡多数来白内蒙占、山曲、陕阳等地。W此，本次采样实际所涵盖的地区远不Ir上述儿个省市，马属的隐孢子虫感染情况在围内没订目前资料报道。冈此，本次调布的马属动物肠道寄生虫和隐孢子虫的流行病学结果基本能够代表我国北部地区马属动物该类寄生虫的流行情况。24 河南农业大学博士学位论文第三章马属动物隐他r基十SSUrRNA的PCR—RFLP及种系发育分析第三章马属动物隐孢子虫SSurRNA基因PCR．RFLP及种系发育分析l引言隐孢子虫作为一种重要的人兽共患寄生性原虫，在世界范罔的多种动物包括马属动物均有寄生。日前鉴定的24个有效种中，以C．parvunl"J,j重要的人兽共患虫种，在多中家养动物中发现。冈此，家苴的隐孢子虫流行情况备受重视，近年米各国学着报道了人量关丁．十、猪、羊等动物的隐孢子虫流行情况。随着分子种类和、lF删鉴定方法的建立，对动物源隐孢子虫的研究也趋向丁分子流行病学方向发展。基丁基冈分析法对马属动物隐孢子虫的研究己报道的种类为cparvum[77-83,87】，horsegenotypel751，Chovis‘76]1。l1it⋯±⋯H-0．⋯。住分子流行病学调布中，小亚基核糖体基冈SSUrRNA是目前比较常用的隐孢子虫基冈分析l‘具。以它作为靶1：}7：点的优点是：阿先这个基冈是多拷贝的，I二J时存在、l，保守平¨高变区域，比较适合丁．设计属特异性引物。SSUrRNA是真核’E物的核糖体DNA(rDNA)的组成成分之一，核糖体DNA通常有人弧基rRNA币11小弧基rRNA2N成，为篮白质合成提供场所，两个人小弧基之间存在间隔序列，包括两个转录间隔区5．8SrRNA基闪。5．8SrRNA基冈平¨人rRNA弧基的序列保守性很强，而转录间隔区(ITS．1、ITS一2的序列的同源性很小，便丁二设计种属特异的引物。不同隐孢子虫种的序列信息已经清楚，为建立l8SrRNA限制性l内切酶酶切方法提供了便利，基YSSUrRNA基冈约830bpK嫂及利川Sspl平ll脚I限制性内切酶进行酶切的分型方法最为常见【"oI。为便]二利GenBank上众多的已知隐孢子虫种类和基冈序列比较，选川该基冈为粑基冈对马属动物隐孢子虫种类进行鉴定利种系发育分析。2材料与方法2．1隐孢子虫样品经试验一显微镜检查的包括疑似样品在内的222份马属动物的粪便样品。2．2隐孢子虫DNA提取本研究中使川美国OMEGA公司生产的E．z．N．A．“StoolDNAKit(OMEGABiotekInc．，USA)。基闪组DNA提取之前，H』蒸馏水列保存丁‘2．5％重铬酸钾溶液中的隐孢子虫⋯性粪便悬液洗涤3-5次，眺除玄重铬酸钾。提取流程：(1)取O．29隐孢子虫卧眭粪便样品Jj2mL离心管中，加入3009LSPl裂解液、109L蛋白酶K、200rag玻璃珠；(2)漩涡宸荡5min；(3)70。C孵育5rain，漩i呙震荡2rain后再孵育5rain：(4)冰浴2rain后加入100pLSP2缓冲液，漩涡震荡30sec；(5)冰浴5min后15000r·rain‘1离心5min；(6)吸取上清液至一新的1．5mL离心管中；(7)加入2009LHTRReagent，室温孵育2rain，l5000r·min。离心2rain：(8)吸取250BL上清液至一新的2mL离心管中，加入250pLBL缓 河南农业大学博上学位论文第三章马属动物隐孢了皋于SSUrRNA的PCR-RFLP及种系发育分析冲液和250pL无水乙醇，漩涡震荡10sec；(9)将第8步中获得的750mL溶液加至HiBindDNA过滤柱中，15000r·min。离心1min；(10／30DA．500BLHB缓冲液，l5000r·min。l离心1rain；(11)加入750pLDNA洗脱缓冲液，15000r．min。l离心1min；(1乃加入200pL洗脱缓冲液，室温孵育2rain；(13)l5000r．rain‘l离心1rain，收集DNA提取液并标记保存。2．3基于SSUrRNA基因的PCR。RFLP分析以及序列分析在本研究中，隐孢子虫基闪分玳方法采JL}jXiao等117011999年建立的基丁SSUrRNA基闪的PCR—RFLP分析以及DNA序列分析。2．3．1三种扩增试剂的比较在预试验中发现，提取的马属动物粪DNA样品住使JIJ通常试剂卜，SSUrRNA基|灭|扩增效率不高，为寻求一个高效的扩增试剂，选川不同公司的二种试剂，按照试剂说明I5推荐的剂量和SSUrRNA扩增反应条仆和同绸引物进行了试剂筛选。使JL}J的待检样-llII为本实验室保存的C．parvum卧|生DNA币¨本次试验}0检的94号马属动物粪便提取的DNA样品。二种试剂的反应体系配比如卜：试剂1：TOYOBO公司生产KODFXNeo(CodeNo．KFX．201)反应液的配制：成分体积(btL)2xPCRbufierforKODFXNeo252mMdNTPs5KODFXNeo(IU／pL)1ForwardPrimer(25pM)1ReversePrimer(25I_tM)1DNA模板1水16ThfalS0试剂2：华人基冈产品TransGENB反应体系配置：成分10xEasyTaqbuffer2．5mMdNTPsEasy购DNAPolymerase)ForwardPrimerr25pM)ReversePrimer(25pMDNA模板水Tbtal试剂3：康为世纪公司反应体系配置：成分otechDNAPolymerase试川装2xTaqMasterMix体积(I．tL)26㈨能；4吣：：。娜如 河南农业大学博上学位论文第三章马属动物隐孢了基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析2x2xTaqMasterMix25ForwardPrimer(25JaM、ReversePrimerf251aMDNA模板水Total212050反应条件：PCRl退火温度为55。C，PCR2退火温度为58”C；PCRl：94。C预变性5rain，35个循环为94。C变性45sec，55。C退火45sec，72℃延伸lrain，最，|亓为72。C延伸10rain降至10℃保存。PCRl、PCR2模板量均为1．59LPCRl产物。2．3．2SSUrRNA基因PCR扩增SSUrRNA基冈引物信息址表3．1。PCR反麻程序为：94。C3rain，1个循环；94℃45s55℃和58。C(分别为第一套和第一二套引物)45s，72。C1rain，35个循环；72℃7min，1个循环。PCR扩增酶为日本TOYOBO公司生产的KODFXNeo201扩增酶。PCR扩增反应体系见表3-2。2．3．3基于．却l和VspI限制性内切酶的RFLP鉴定隐孢子虫SSUrRNA基冈PCR产物检测使川1％的琼脂糖凝胶．RFLP产物检测使川2％的琼脂糖凝胶，核酸染料为GelRedTM(Biotiuminc．，Hayward，CA)。凝胶成像系统为lnGeniusLHR(SynGene，UK)。100bpLadderMarker和DL2000Marker为TaKaRa公司产品，购白人连(宝)生物r程有限公司。不同隐孢子虫酶切片段数和片段K度参考表3-3．11,1701表3-I用于隐孢子虫基因分型的SSUJ．RNA基因引物Table3-IPrimersusedinthecharacterizationoftheSSUrRNAgeneofvariousOTptosporidiumspecies27 河南农业人学博Jj学位论文第三章马属动物隐孢了皋十SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析表3—2SSUrRNA基因PcR扩增反应体系(25[tL)Table3-2ThereactionsystemofSSUrRNAgcnePCRamplification(25laL)SSUrRNA基冈PCR产物使刚限制性内切酶№pI和脚l(Fermentas，NJJNI)进行RFLP鉴定。试剂配制：试制名称配比(,ttL)Bufier2酶0．8水6PCR产物8酶切条rI：放37℃水浴中酶切5h2．4SSUrRNA基因PCR产物测序隐孢子虫SSUrRNA基冈第二套PCR产物纯化后直接进行洲序，每个样品均进行烈向洲序，测序峰图不佳者再次送样洲序。测序由，IL京诺赛基冈组研究中心有限公亓]完成。测序仪删号为ABI3730XLDNAAnalyzer(AppliedBiosystems，FosterCity，USA)，测序所J}J试剂盒为BigDyeTerminatorv3．1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems，USA)。2．5种系发育分析每个样品烈向测序获得的2条序列使刚ClustalX1．83(tip：t／tip—igbmc．U—strasbg．if／pub／CIustalX／)软什进行完伞比对，对照比对结果利洲序幽谱，获得校准序列。校准序列使川BLAST在GenBank中进行搜索，卜载参照序列后使川Clustalx1．83软件进行再次比对并进j7,1Z,要的手’l：凋整。调整比对斤的文1"1：生成．phy格式，种系发育关系进化树使fLIjPhylip3．6728 河南农业大学博士学位论文第三章马属动物隐孢予基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析软什构建(http：／／cmgm．stanford．edu／phylip／)。本研究中，采川邻接法(Neighbour-joining)使,q4Kimuro2-parameter建树模型。进化树可靠性用bootstrap进行分析，使刚1000个重复。生成的进化树文件使川TreeViewl．6．6(http：／／en．bio．soft．nefftreefrreeView．html)打开，进化树的修饰使川软什MEGA5．0(http：／&n．bio．soft．net／tree／MEGA．html)，进化树的标注在PPT中进行。表3-3不同隐孢子虫种类SSUrRNA基因限制性酶切片段长度⋯70Table3-3RestrictionfragmentlengthintheSSUrRNAgeneofdifl；erentCryptospo／’idiumspecies3．结果3．1三种试剂扩增效果比较在使用了三种试剂用同样的样品DNA和同样扩增条件’|、．，电泳检奔扩增效果，结果如图3—1。可见，Toyobo公司高效扩增显示了较好的扩增效率，K为康为世纪公司试州装2xTaqMasterMix对附陛样品只显示了微弱目的带，而且扩增产物早弥散多带刑，华火基因公司试剂没有出现扩增产物。本试验中不易扩增的样品都采用Toyobo公司的高效扩增酶进行PCR。3．2SSUrRNA基因PCR扩增结果对222份附胜和疑似样晶的基冈扩增结果发现，共有114份扩增山目的条带，部分扩增的条带电泳图见组图3—2。其中有部分样品的扩增条带略人y-SSUrRNA日的条带，这些扩增的样品也做了卜一步试验鉴定。’9 河南农业人学博士学位论文第二章马属动物隐孢了景于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析图3．1三种不同试剂的扩增效率比较C+：为C．parvttm阳性DNA，X为94号驴粪样DNA，其中H为华大公司试用装；T为Toyobo公司高效扩增试剂，K为康为世纪公司试用装。M为蛋白分子量标记物。Figure3一IPCRefficiencycompareof3differentreagentsc+：CparvumpositiveDNA；H：Huada’reagent．T：Toyobo’reagent；K：Kangweishiji’reagentM：Markers --～●-：；’=；’二j⋯o■o⋯‘；‘；■二-=j■1893202217218t21822452512622652鹋M274281312357i3572359l。_。_-一-⋯．■■253037404749QIS0MS08994959697-700一言嚣嚣篇_50030028529229131l312313315323M330331333334335336337M。3393403413443[=口-_一____-一一lime-_一●_●2I227l723040C40C46C51757797M101110121351135216116611662174_o■一．1000。-7SO-■357359364367369M371S1S2102234243245M249251274312331：■■—●■●_一_●●■w⋯蔓!—一}，+■■_-。150102148199247M285335337364_-一10一----0一一_-_女{M193195197234× ，lS一1000．．1000●7sOlS9S13S22S30$32S33$34$37$43：$45$47．$51$53$65$68$72$83$87$90$95S105S106．}[]—-I蠢ji瓣髓≤罐：鞘口蕊翳戆蚕◆懑薹M778599101135—■O加：．‘笺141178192218．"蚕243312180182183186189192M嘉“。．。MSlS9S13$22$30$32$33SM$37粥辎辨蹬l$55S05$68s72$83s87$90$95SII葛S106}．●_一口■}蕊棼谣￡’霭曩一阚■鼓楼碉紧镧黪雄《习■●-书容HmR?i¨越。：港髂图骶麓醚 ’’l。河南农业大学博二L学位论文第三章马属动物隐孢子基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析图3．2隐孢子虫分离株SSUrRNA基因PCR扩增结果图中代码分别为各采样点的样品编号，其中2，40，75等为来自山东济宁驴样品，S2等为来自山东嘉祥驴样品，SL4等为来自四川样品，C46等为来自河南长垣驴样品，B2l等为来自河南泌阳驴样品，QY4等为来自河南沁阳样品．M4等为来自马的样品，M为标准分子量蛋白，Ql、SO为隐孢子虫阳性对照Fig3-2ThePCRamplificationofCryptosporidiumisolatesbasedonSSUrRNAgeneTheserialnumbermarkeredinfigurewereoriginalnumberfromdifferentsamplingsites，inthatofthem，2，4；75etalwerethesamplecollectedfromofJiningofShandongprovince，S2etal，SL4etal，C46etal，B21etaI'QY4etal，M4etalwerecollectedfromdonkeyofJiaxiangofShandongprovince，Sichnanprovince，donkeyofChangyuan，Beiyang，QinyangofHenanprovince，andhorsesamplesrespectively．Mismarker；QI．Songarepositivecontrol3．3基于SspI和VspI限制性内切酶的RFLP鉴定结果对PCR扩增山目的条带或者接近目的条带的PCR产物进行酶切鉴定，共发现四种不同的带型，一种和cparvwn产生的带型相似，Sspl酶切后产生二个可见的条带，分别在448，247和106bp，在Zspl酶切后产生628311104bp的带型，女1340，75等样品。一种雨IC．parvumk目近，片段人小稍有区别的带璎如118，123，124等，在曲叫酶切产生的幽谱和c．parvum一样，而在Vspl酶切后产生的人分子最条带略人丁．C．parvum：一种和horsegenotype相似的带型，一种特别的带型，在两种酶切显示较大分子量带型，似乎没有SSUrRNA基因所特有的酶切位点，如323，M7l、M8l、M91该类样品的扩增产物在电泳检测时就发现其片段大小都略大于SSUrRNA目的片段，后经测序分析，发现为环境真菌。隐孢子虫种类或基因型及非特异型扩增情况见表3．4。部分样品的酶切带型呈现不规律的状态，怀疑是隐孢子虫混合感染导致。3．4部分样品种系发育关系对扩出目的条带的样品中的52个进行测序分析，通过ClustalX1．83软件进行再次比对并对扩增样品测过的部分序列进行了初步分群(见图3—4)，这部分序列大部分样品归属于鼹大群，少数样品在其他不同的位置。将不同种群中选JLIj两个序列进行种系发育分析(见剀 河南农业大学博士学位论文第三章马属动物隐他了皋十SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析(3)34 28529231l3133li323330333334335336337339340341344346347352356364371一一¨一“一一_一一一一_一-_mid一-im一一。一-一××襽××襽×┃1Ш┃M25223133353330333435363739303134363732┃┃--“-_-：--al┃稀§镰．1iraM89495610121614151617181013141617181913┃～一一-_一一-┃，。-o_┃M。疑M8949561000210614[15116，廛7n载10，13141617181913┃茎-。?二二-o-。毒露．‘：。量、啦艟，，；照：━━━━━━┫┃MꞀ﹢ 河南农业大学博士学位论文第_三章马屈动物隐孢了基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析图3．3部分样品的酶切图谱其中各组图中上为swl酶，下为对应的I劬I酶。组图(3)左面为swl酶，右方框内为)'spl酶切结果。Figure3-3BandingpatternsofSomeofthesamplesmacrorestrietionmapwithSsplandVsplIneverygroup，Ssplenzyme(upperfigure)andVsplenzyme(10werfigure)．Ssplenzyme(1eftfigure)and脚lenzyme(rightfigureinthepane)inthe(3)．3．5)。种系发育分析结果表明这些序列分属5个主要的类群：QY4Q10和米白恒河猴(rhesus)的AFl12569C．parvumCPRMl住同一个分支上，123，126，MA3序列平¨米白美国牛的AFl64102C．parvumIOWA株在同一分支上，262，268与horsegenotype在同一分支上，Q8和ferretgenotype在一个分支上，QYl利minkgenotype及ferretgenotype比较接近。而B57平¨猪源隐孢子虫比较接近。(见表3-4)。对部分序列经完全比对后发现，B57与AFl08861Cparvumpigl一致，即目前为C．suis，同时和AFll5377、JF710259(米白丁猪的隐孢子虫)～致。123、126、MA3等与米白T奶牛的AB513881和隐孢子虫IOWA株AFl64102序列一致，属丁．C．parvum；Q8与AFI12572序列完全一致属7-ferretgenotype；262、268(均为3-6个月的驴驹)与horsegenotype只有1个碱基的差异(414位为A，horsegenotype为G)，属丁．horsegenotype；Q4、Q10与AFll2569．Cparvum／CPRMl／rhesus只有2个碱基的著异，与分别在247、573位发生了T-C的变化，但与常州的标准株C．parvumIOWA(AFl64102)序列有7个碱基的筹异，分别在32、35位发生了T．A和A．T的变换，在245位发生了T-C的变化：在412位发生A．T的变化；在463、465位发生了A．T的变化：在469位比IOWA株多了一个T；冈为IOWA株是公认的Cparvum标准株，该株基冈组已测完，背景清楚，本试验中序列以该株序列做比较为准。s141及364号与FJ262724-rabbite—genotype(目前已命名为Cryptosporidiumcuniculus)有两个碱基在426．427位发生AG到GA位置颠换，另外，364在245位发生了T-C的变异：QYI与Ccuniculus有2个碱基的差异，分别在245位和414位发生了T-C和A．丁的变异，36 河南农业大学博=_lj学位论文第三章马属动物隐孢了基十SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析在426．427为发生AG．GA的颠换。部分基冈序列比对的具体结果见幽3-7。表3．4SSUrRNA綦|六J相似序列差异比对Table3-4SimilarsequencealignmentofSSUrRNAsequence37 河南农业大学博上学位论文第三章马属动物隐他了基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析 河南农业大学博二L学位论文第三章马属动物隐孢了基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析63829319319949189QY412438919225TtASl3180335QY6197Q51C51218MA3123126OH0005图3-4部分样品基于SSUrRNA培IXl的种系发育分析Figure3-4PreliminaryclusteronSSUrRNAsequenceofpartialsamples总之，这些比对的序列中共有12个样^^属T(ipat·1,，bim，2个样品属丁horsegenotype，一个样鼎和猪源隐孢子虫相近，一个样I铺属rferretgenotype，其他的86个样品属’]j新的基冈)Ij。在扩增出SSUI．RNA基冈样晶中，MA3、M51、M10．为马的粪便样晶，这儿个样揣全为(ipal。v“卅，而在所有属丁．新基|大l叶!的样晶呲l全部米白驴。12个属丁C．pa#一VIIITI的动物中，有马属动物隐孢子虫各种类所hI比例址图3-6。3．5不同隐孢子虫种类的年龄分布测定序列样品中．在所属的新基W型中，成年驴7份，驴驹19份；而成年马3份均为cparvum，住所属Cparvum的驴粪样中，有米白成年驴的2份，驴驹的7份；一个属丁ferretgenotype的为成年驴的样品，两个horsegenotype的都是3-6个月瑚、l驹。平¨minkgenotype，C．cztrttcuhts相似的基冈型样品有两个米白成年驴，一个米白3-6月龄的驴驹。隐孢子虫种类、不同动物、年龄分布见表3-6。3．5不同种类隐孢子虫地域分布在酶切和测序鉴定的隐孢子虫种类中，以C．parvum的分布鹾J一，山尔，河南、四JII都有检山，其次是donkeygenotype在tit东、河南和甘肃的马属动物粪样中检山；horsegenotype仅在山东济宁的硒匹马驹中检山；而与C．cuniculus接近的有三个样品，均在山东济’j!的驴驹或成年驴中发现。39 河南农业人学博I：学位论文第三章马属动物隐孢子皋于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析鳓穗震翮羼熏譬嚣嚣萋纛囊嚣渊l||熟囊图3—7部分SSUrRNA序列ClustalXI．8l比对的主要变异区域截图AFI12569、AFl64102、EU437418、FJ428189、AFI12572、FJ262724为参考序列其余为本试验扩增序列Figure3-7ScreenshotofmainalterationregionandgenevariationofpartialSSUrRNAsequenceunderClustalXl．8lAFll2569，AFl64102，EU437418，FJ428189，AFIl2572，FJ262724arereferencesequences，theothersaresequencesinthisstudy4讨论4．1关于马属动物隐孢子虫种类／基因型对马属动物中隐孢子研究国外报道的多集中丁I马，至今尚朱她到驴隐孢子虫分子流行病学的报道。马的隐孢子虫种类以c．parvumJ,J512，另外比较常见的是horsegenotype，其他基冈型为c．parvumcattlegenotypel却C．bovisf79’801。这儿个种类中人兽共患种类是C．parvum和horsegenotype。本次试验发现以驴粪样为主要组成的样品中，有6种不同的种类或基冈型：donkygenotype，C．parvum，horsegenotype，ferretgenotype，C．cuniculus，Cryptosporidium40 河南农业人学博士学位论文第三章马属动物隐孢了基于SSUrRNA的PCR．．RFLP及种系发育分析pig1，结合酶切图谱鉴定，其中新基冈型扩山86个样品，为优势种类。且这些属丁．新基因型的样品全部来自驴，和Cparvum的标准株AFl64102．IOWA株的序列比较有7个碱基的著异，LjGenBank上搜索的AFll2569．c．parvum／CPRMl／rhesus序列比较相近，该序列为1999年提交，当时隐孢子虫分类研究处1-刚刚起步阶段，就目前隐孢子虫分类情7兕来看，这个序列不属丁现在的C．parvum范畴。而IOWA株是目前已经完整测序的C．parvum虫株，现在为隐孢子虫分子流行病学和生物学研究的标准株，本试验序列比对也以此为标准株。109，25表3-5基于SSUrRNA基因扩增产物酶切及测序鉴定分类Table3-5c憎pmspI)rifliHmspeciesclnssifiedbyPCR-RFLPonSSUrRNAandsequencing号等米白驴的隐孢子SSUrRNA序列矛¨该序列比较有7个碱基的差异，按照现行的隐孢子虫Ⅱ型分类标准，可以视其为一个新的、限型，义冈为这个新的弧型全部米白驴的粪便样品，为此，将其命名为donkeygenotype。6个种类／基冈型中的c．p口rv删共12个样品，其中来自驴的样品占到9份为72．73％，马的样品为27．27％，说明马和驴的隐孢子虫均有Cparvum这种人兽兆患的种类。在本次调查中只发现2个样品中含有horsegenotype，表明horsegenotype4 河南农业大学博二【．学位论文第三章马屈动物隐孢了皋十SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析iumpi91图3—5代表序列基于SSUrRNA基因Neighbour．ioining法(Kimura2-parameter模型)构建的种系发育关系进化树Figure3-5Evolutionar．,,’relationshipsamong(1f37)toapot’Miumparasitesinli：rredbyneighboLl州oinin￡ana’3sis(usingKimura2-parametermodel)OnSSUrRNAnucleotidesequencesofrcpresentaIivesamples不是我国的马属动物隐孢Ji虫的主要种类。本试验中其它少数种类的山现表明我国马属动物隐孢子虫既有优势种，也具有种类或基冈的多样性。已有报道发现新阳兰腹泻马驹的隐孢子虫基冈具有多样性，这些马驹的分离株基冈序列和从人及牛分离的相近【8引。4．2不同龄马和驴隐孢子虫种类／基因型在发现的隐孢子虫种类／基⋯型中，优势种类donkeygenotype米白驴驹利成年驴，其中米白成年驴的样鼎有10个，八月龄以h的驴驹的76个，而米白马的样品没有发现该种类。本次试验结果表明，donkeygenotype是驴特别、卜岁内驴驹的主隐孢子虫感染种类，iII‘测序样。uI的19／26，成年驴III7／26。米白成年马的3个隐孢子虫样品均为C．parvum。这3匹马中有一匹马驹，两匹成年马。住所属Cparvum的}t晶中有5个水白3．6个月的驴驹，其他的3个来白成年驴。上述结果表明，在我国，码感染隐孢子虫的主要种类是C．parvum；两个horsegenotype样品均来自驴驹。ferretgenotype样品米121成年驴，这个基因型显然是马属动物少见的基因型。和C．cuniculus接近的序列有3个，冈为已有人感染C．cuniculus的报道，．42 河南农业大学博：l：学位论文第三章马属动物隐孢子基于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析这两个近似基因型的出现也值得关注。2个米13泌刚驴保种场的1．5岁育成驴的样品SSU▲．新基因型C．parvumHorsegenotypeRabbitegenotype?Ferretgenotype图3-6马属动物隐孢子虫种类所占比例Figure3-6PercentageofCryptosporidiumspp．insamplesfromequine表3-6马属动物隐孢子虫种类／基因型分布Table3-6Cryptosporidiumspecie／genotypedistributionofequus表3—7主要隐孢子虫种类地域分布Table3-7ThemainCryptosporidiumspeciesdistribution隐孢了虫种类Cryptosporidiumspecies分布地区／数量Distribution／numberdonkeygenotypeCparvumHorsegenotypeCcuniculus．1ik山东／77；河南沁15兀／3：l|肃天祝门山东／6：河南沁阿]／2；河南长垣／l”肃天祝／2；四川阿坝／1山东济宁／2山东济宁／343 河南农业人学博I：学位论文第三章马属动物隐孢了皋于SSUrRNA的PCR．RFLP及种系发育分析rRNA基冈序列和来臼丁猪源的C．parvum／pig1一敛，这可能是该场泌刚驴来白农户饲养至成年收购到保种场，在农户家L}I饲养期间和猪等动物在相同的活动场地，或者是饲草污染所致，具体原冈有待丁进一步考证。Graczyk等(1996)ll乃J就经试验证实，给无隐孢子虫的北京鸭L]服C．pat·vum，感染斤7天后，组织学检布布明这些f|IIj米被Cp口rvIAm感染，但从受试鸭收集的粪便样晶可以感染新生BALB／c小鼠。表明1r白然宿主的动物在食入隐孢子虫时，j{：不能感染动物而仅仅穿肠而过，但是这些卵囊照样可以感染白然宿主。有报道发现腹泻马驹土要是甲．期感染了(ipal·Vlglll，而且显示有腹泻症状Ⅲ⋯，由丁本次调布的马属动物均属丁3个月龄及其以上的动物，洞布时只有一匹隐孢子虫⋯性的驴驹(编号$43)有腹泻症状，并术址其他马属动物有明显临床症状。我国幼龄马属动物隐孢子虫优势}o?donkeygenotype的年龄分布和致病性还有待j二进步调布研究。43马属动物隐孢子虫种类地域分布与养殖方式的关系从主要隐孢子虫种类的地域分布来看，以IJJ尔养殖数封多，养殖密度人，存本洞夯采样时发现某些养驴场平II牛千混养；而隐孢子虫种类分布交多的是河南沁刚马属动物交易市场，这个市场基本是北中国马属动物最人的交易中心利集散地，由丁其特殊的环境，所持采集的样品米白不同的地方，但由丁市场没有详细的记录，无法一一对戍马属动物的来源。结合本研究的第一．章流行病学凋布结果，可以基木断定，隐孢子虫种类和流行情况受养殖密度和养殖环境的影响，密度人，周闱有其他食草动物，交易和串换动物可能是马属动物隐孢子虫种类较多，分布J、。泛的主要原冈。4．4马属动物隐孢子虫显微镜检查和基因扩增效率扫：报道的马属动物隐弛子虫凋卉中，甲}{}j的研究卞要是侧重丁．显微镜检夯，粪便隐孢子虫刚性率在1．7％剑27．87％之间I75-89]，多数分子流行病学凋布没有刚性率报道。但是住Perrucci等176】的研究中发现并不是所有的刚性码匹每次都能检剑隐孢子虫，这和隐孢子虫的间歇性排出有关。在本次试验中，⋯性样品或疑似|j||．陛样品总计有222份，实际能扩增山日的带的只有114份，IIt检布数的51．35％，和基冈扩增的敏感性似乎有矛盾，但足显微镜检夯的样品是取109粪便经饱和『蔗糖溶液浓缩浮集后检卉每份样品做了至少20个视野的仔细观察，只要发现有一个隐孢子虫或者疑似隐孢子虫的都记为刚性进行基冈扩增试验。而做基冈扩增时提取DNA时，仅取了0．29的粪便样鼎进行处理，样品总量为显微镜检的2％，扩增时模板的川量仅为luL，冈此，看起米原始粪样苗的人小是基冈扩增效率没有显微镜检高的主要原冈。此外，在扩增山条带的样品中，有8个样晶经酶切鉴定发现与隐孢子虫样品的酶切条带有显并不同，经测序后发现，这些样品是环境真凶。本次所采的l302份样品以基冈扩增隐孢子虫|j|1J|生的102份样品米计算，隐孢子虫阿I'1生率J,．t7．83％。这和美国f751、意人利⋯、波、?[84-871调查结果相近，比巴两188]、伊朗H-s3]等报道的刚性率低。44 河南农业大学博士学位论文第四章马属动物隐孢子虫gp60基因的亚型分型研究第四章马属动物隐孢子虫gp60基因的亚型分型研究l引言隐孢子虫的分类研究中，从形态学观察结合动物宿主及致病性等生物学特性，剑后期的分子方法鉴定，使人们对隐孢子虫的认识逐步深入。就分子诊断I：具的发展米看，从基本的隐孢子虫基冈分孤纠+具如SSUrRNA，剑第二代的弧19分玎¨：具如gp60，目前已发展到第二代的多何点遗传结构分析分璎1．贝。这些分叶!I：具的府川为很多研究者提供了方便之处。Laxer等151首先建口了基冈扩增的方法检测粪样中的隐孢子虫。在基冈分开11I具中，SSUrRNA基冈、HSP70基冈(70kDaheatshockproteingene)、HSP90基冈(90kDaheatshockprotein)、COWP基冈(Cryptosporidiumoocystwallprotein)、actin基冈等。口前最为流行的弧矸9分璎l：具为60kDa糖蛋白墓冈(gp60，也称为gp40／15)。gp60基冈的5’端(gp40)具有编码丝氨酸的二核营酸TCA，TCG或TCT串驳重复。除了二核营酸巫复数量彳r变化外，在1}重复区也存住J’‘泛的序步《筹异性，从而将C．palⅥ删利('．hominis区分为许多弧犁家族。在每个弧型家族，各弧型之间lK分主要依据二核苛酸重复数量(TCA，TCG或TCT微甲足)。基Tgp60基冈，一一螳与C．parvum利cihominis比较接近的隐孢子虫种类或基冈型也町被进一步分曩!，包括(1-meleagridis，Ccunicuhts，Horsegenotype，Ferretgenotype等。gp60基冈有序列异质性和生物。字：的相关性，冈此，J1。泛应川丁隐孢子虫_F型分型。在隐孢子虫基W组中，该基冈是目前已经鉴定的最为单一的多态性分子标记123．1701。此外，gp60也是功能基冈，它位r寄生虫侵入阶段顶端区域的表面，是人体内中和抗体反应的优势靶点之。因此，该基冈伉点的麻川可能将隐孢子虫的生物学特征剐I儡床表现与不同的弧删联系在一起。如C．parvum亚型家旗JJa和JJd发现丁．人和反匀动物，引起人兽共患隐孢子虫病。为探讨我国马属动物隐孢子虫的公共卫生意义，本研究采州这个基冈传点对马属动物隐孢子虫进行哑型分析研究。2材料与方法2．1隐孢子虫样品1144"SSUrRNA基冈扩增附I生样品均进行gp60基因扩增。2．2基于gp60基因的亚型分型本研究中，马属动物隐孢子虫附l生样nIJn亚型分巧!采用DNA序列分析gp60基因：gp60基冈微卫星重复羽I引物序列等信息见表3．1。PCR反鹿程序为：94℃5rain，1个循环；94℃45s，50。C45s，72*(21rain，35个循环：72℃10min，1个循环。PCR扩增试剂和扩增体系见第二章2．3．I。45 河南农业人学博士学位论文第111=|章马属动物隐孢予虫gp60基因的亚型分型研究表4．1隐孢子虫亚型分型的gp60基因引物Table4-lgp60primersusedinsubtypingofCryptosporidium微一p星重复引物序列(5‘to3‘)退火温度(℃)』；‘段火小(bp)MicrosatelliterepeatPrimerSequence(5‘Io3。)AnnealingtempFragmentsize2．3gp60基因亚型命名gp60亚型的命名采用先前建立的命名原则¨741。目i，J．，已有11个隐孢子虫种类或基因型被亚型分型，即Chominis，Cpal。vum，Cmeleagridis，Cfayeri，Ccuniculus(以前为rabbitgenotype)，horsegenotype，Cwrairi，ferretgenotype，Ctyzzeri(曾为mousegenotypeI)，minkgenotype和opossumgenotypeI，其亚型家族分别对应于I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X和XI。新亚型分型的种类以罗马数字依次往下排序。2．4gp60基因PCR产物凝胶电泳检测gp60基冈PCR产物检测使川1％的琼脂糖凝胶，其它试剂参见第三章中的2．3．1和2．3．3。2．5gp60基因PCR产物测序所有gp60基冈PCR产物全部测序，其它参见第二章中的2．4。聚类分析参}!镬第二章的2．5进行。部分参考序列址表4—2。3．结果3．1gp60扩增结果共有25个样品扩增山gp60目的片段，部分样『}i!，电泳检布结果址幽4-1。图4．1部分样品gp60基因扩增产物电泳结果Figure4-lThePCRamplificationofpartialCw．ptosporidiumisolatesofgp60gene3．2gp60亚型鉴定对所扩的序列测序和校准后与GenBank上已知序列比对后，对不同样品的序列和本试验室人源隐孢子虫序列进行聚类分析，结果见图4-2。其中102。315为本次试验样品的一个 河南农业人学博．_I：学位论文第四章马属动物隐孢了虫gp60基因的Ⅱ型分型研究族群，GPwang-ZZS2773GP5为本试验室采集白人的隐孢子虫gp60序列，这些样品白成一组；M3平¨123号样品在同一个分支上，而Q5平¨QlO与米白开封的人源隐孢子虫株GPKF2同属一个分支。将所获得的gp60序列通过搜索比对，参考GenBank上的已知序列对白扩序列鉴定弧艰，所}}Jt要参考序列她表4—2。表4-2gp60基因亚型鉴定参考序列Table4-2Referencessequenceofgp60subtypesFJ43596(1HorsegenbpeDQ648547(、．1)ol-v'itmHQ009809(1paJ。vltmAB5l4089Cpm’!,'lllHGU458803AYl67591GU214368(P“，。wfJ"(1_D“rV|lnl(1_f)“，-v“j”EF208067(1．hominisAYl67594horsePrezewalski’SVIaAllG3genot)’pe、vildhorseIglaAl5G4A19GlA20GlA29GlA18G1caIfA22G2RlHomosapiens2A24-IalDQ665692(一hominisldIdA6Homosapiens140mosapienschildCzechRepubliCNorthemIrelandChinaEgyptJordanItabUnitedKingdomUnitedKingdomJapanndia：Kolkata【107]【I75】【I76】【I77】fI78】【179】【180l118I】【l79】【14】FJ262734rcuniculusVbA29rabbitChina【I17】HQ397718fcltniclthts"VbA32rabbitChina{182】GU971644fclmiculusVbA22HomosapiensUK【183J按照gp60弧型的命名原则共发现所获得的扩增产物分属二个不同的Ⅱ家族：VI、IJd和一个新的弧家族，新弧家族按照依次类推的方式命名为XII；二种不同弧家族中，共发现四个弧型：horsegenotype家族VI中两个样品均是VIAlIG3弧型，lld弧家族中西个样品均属lldAl9G1，结合SSUrRNA基|灭1分类结果，利123号样品同属C．parvum的120，M51，c51，218，Q6I，M101，118，Q51，330也为c．p甜vumⅡ丑!lldAl9G】。在新家族中，有两个样晶属丁．XIIAl6Ⅱ型，其余19个都为XIIAl6G1弧删。结果见表4-3。3．3gp60优势亚型Gp60弧型分析结果发现，二个不同家族中，所属xII家族样品数量为21个，-。I‘84％，和基于SSUrRNA的分类结果一样，donkeygenotype为优势种类，其余两个瓶裂所i叶比例各为8％。结果见图4．2。47k睫盯咖一卅泖州i=，¨旺旧婴㈣阶㈣JdCd }iI『南农业火学博上学位论文第四章马属动物隐他了虫gp60基因的亚型分型研究31535619319994129254012712696QY4QYl1783789114234115100102GPwangGPzhai"19GF’zhouGpkFlGPpIgGPl46ZZS2773GP5M3RM3123GPKF2Q5010百々r百1百—i占ri苦i—i占了—i占i—石_bo图4．2马属动物隐孢子虫gp60序列和人源序列的聚类分析Figure4-2Clusteranalysisofequinesamplesandisolatesfromhumanongp60genesequence图4-3基于gp60基因的不同亚型家族组成比例Figure4-3PercentageofCryptosporidiumsppsubtypefamiliesinsampleson96048 4-3gp60基因亚型分型TableSubgenotyplngofisolatesongp60geneNumberofsamplesSubgenotypeongp60subtypef、amiliessp。。’。5丽_————而而『———可————而面而万一Q10VIAlIG3VIHo。s。genotyp。123IldAl9G1lidr17““⋯1M3lldAl9GIlidLpa“72‘”2QYlXIIAl6XllDonkeygenmyp。OY4XIIAl6XIIDonkeygcnotYP。25XIIAl6G1XIIDonkeygenotyp。37XIIAl6G1XIIDonkeygenot)‘P。40XIIAl6G1XIIDonkeygenotype89XIIAl6G1X11Donkey’genotYP。94XIIAl6G1XIIDonkeygenotyp。96XIIAl6G1XIIDonkeygenotyp。102XIIAl6G1XIIDonkeygenot37pc100XIIAl6G1XIIDonkcYgcnotyp。l14XIIAl6G1XIIDonkey’genotYP。lSXIIAl6G1XIIDonk％genotyp。126XIIAl6G1XIIDonkeygenotyp。127X11A16GIXIIDonke)’genotYP。I29XllAl6GIXllDonkeygenotypc178XIIAl6GIXIIDo“哪genotyp。193X11A16GIXIIDonkey'genotype199XIIAl6G1XIIDonkeygeno哆p。234XIIAl6GIXIIDonkeygenotYP。11SX11A16GlX11Donkey'genotyp。356XIIAl6GIXIIDonkeygenotype4．讨论4．1--qN动物隐孢子虫亚型马属动物隐孢子虫种类署¨弧开!分类研究主要基3-ssurRNA、gp60、COWP基冈[75．761，已经报道的种类和基冈型为cparv“m，horsegenotype，C．parvumcat“8geno‘YP以及c加rv”mboviso其中孤型有vlaAl4G2㈣，IIaAl8G3R1㈣，VIaAI1G3[801．VIbAl3‘1841。本试验发现我国马属动物尤其是驴的隐孢子虫有国外报道常见的horsegenotyp。VIAl1G3外'尚有IIdAl9G1、X11A16、XIlAl6G1基冈型。其中cparV“mIIdAl9G1属于人兽共患的种类，也是首次在驴粪样中发现lldAl9G1和XIIAl6、XIIAl6G1这三个基网弧型。这二个基因型中，尤其以XIIAl6GI为优势基因型。这和其他马属动物隐孢子虫的报道有显鞘不同。49 河南农业大学博二【：学位论文第pU章马屈动物隐孢f虫gp60基因的弧型分型研究4．2驴隐孢子虫亚型的人兽共患风险本试验检出的人兽共患基冈型或孤型中，就lldAl9G1而言，已经报道在葡萄牙的3个HIV附|生病人中查剑该基因型，在葡萄牙调夯的人C．parvum分属于Ila(9／25)，lid(8／25)，IIc(7／25)平11lib(1／25)，可见存葡萄牙，Ild为人隐孢子虫感染的主婴Ⅱ竹!之一IL851。尽管在葡萄牙里斯本的AIDS病人中常见IId弧家族，但住葡萄牙国内只有部分地区的动物中发现这个弧家族。此外，在匈牙利的牛和阳班牙的羔羊及意人利的一只山羊上发现中都发现了这个基冈Ⅱ型【186舶训。国内Wang等(2011)162Ⅵ：河南省断奶前犊牛的隐孢子虫分子流行病学调奄中，gp60基冈分析碌示C．pal·vitro样『诮均属丁I同一弧型IIdAl9G1，表明lldAl9Gl在家告中较为常见的弧型，gp60Ild家族在人的隐孢子虫感染中比较常弛，已经报道的国家有爱尔、!、葡萄爿：、荷兰、科威特、约口．等围家，地表4．4。这些带虫动物包括本研究中的驴都可能成为人感染隐孢子虫的米源。表明我国码属动物的隐孢子虫具有重要的公共下生意义。基冈弧删xIIAl6、X11A16G1是首}欠发现的珊’l隐孢子虫基冈弧型，而且在所扩增的25个gp60样品中，这个弧刑Ilf绝对优势，该弧删对动物的致病力、对人是否具有感染性尚不明确，需要进‘步的试验探索。表4—4fpatqⅢⅢ8p60亚型家族在人的分布Table4-4Distributionofrt)n，wMlgp60subt5’pefamiliesinhumans儿章／成年人HIV+成年人儿童／成年人1i叫确1iI蚶确儿童儿章儿童50宝呈．盆∞叭蛇M吣舛％C●41vC83，黔●伸8O7●，O2●⋯20O0O0O0弛94Ⅻ驱勰0”0"”¨o姐钾如●叭¨一惭虻一帔一缈 _}IT『南农业人学博』：学位论文第五章马属动物贸第虫基十TPI和GDH基凶的种系发育分析第五章马属动物贾第虫基于TPI和GDH基因种系发育分析1引言贾第虫是全球分布普遍存在丁脊椎动物肠道寄生性原虫，该虫主要通过食物或者饮水传=I{{}，可引起动物腹泻，也是人类常见的腹泻病病原。很多动物是人兽共患贾第虫的储存宿主，如家养和野生反刍动物，羊驼，猪，马，家犬和野犬，猫，雪貂，啮齿动物，有袋类动物利其他哺乳动物等，多数动物携带贾第虫但并不显示症状，这样的动物有对人潜在传染的可能。而发病动物则出现带血．或者粘液状的粪便。冈Ⅱh，动物的贾第虫流行情况和基冈型分布受剑人们的重视。首先Pavlasek等Il如】(1996)报道了捷克马的贾第虫，报道随着分子牛物学技术的发展，目前对贾第虫的研究多是鉴定野生动物利多种家卣中的Gduodenal&基冈)19，以鉴别这些动物的贾第虫种类利基冈艰，布明是否有滞在人兽共患的种类。贾第虫分r分?I,J的方法中上婴采川的基⋯位点有贾第虫特异性的、Gduodenalis特异性和聚集体特异性的基冈，如小、IF基rDNA(SSUrDNA)、VPS基冈(variablesnrfaceprotein)．GDH基冈(glutamatedehydrogenase)，TPI基冈(triosephosphateisomerase)，ELFA(elongationfactor1alpha)，B甲第素基冈(betagiardin)等[44,47,51-56]。这些基冈在贾第虫分子流行痫学中均有应州，在各种家畲广卜．牛、猪、山羊、绵羊、犬、马、兔、猫等动物的贾第虫流行情况均有报道，这些动物中以牛、猪、山羊、绵羊、猫等发现有人兽共患贾第虫基冈型。为了解我过马属动物贾第虫流行情况，本研究川TPI和GDH两个基冈何点对马属动物贾第虫进行分子流行病学调布和种系发育分析。2材料与方法2．1贾第虫样品第二章试验中所采马属动物粪样经显微镜检贾第虫早同I性的样品(住第二章表格中统汁在“其他寄生虫种类”中)7份和术检剑贾第虫包囊的6月龄以r‘马属动物粪便共80份。2．2贾第虫基因组DNA提取马属动物贾第虫基⋯组DNA提取参见第二章中的2．2。2．3TPI基因和GDH基因引物参照Sulaiman[1441等的方法，根据贾第虫TPI基冈序列设计2对引物。见表5—1。参考Boontanom等人的方法1196]合成GDH引物(见表5．2)。上述引物均有北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。2．4PCR扩增马属动物贾第虫分离株TPI基冈jfIIGDH基冈片段的扩增使川KODFXNeo．20I扩增酶。PCR扩增反应体系见表5．3。PCR反应程序： TPI基因：第一次反应：预变性94。C，5min；然后35个循环：94。C，45sec；55。C，45s。。：72。C，1rain：最后延伸72。C，10rain。第二次反应：预变性94。C，5min；然后35个循环：94。C，45sec；55。C，45sec；72℃1min：最J『亓延伸72。C，lOmin。表5-1贾第虫TPI基因引物Table5-ITPIprimersofGiardia5to3p日物序列(’’)退火温J蔓Lo，J卜I敬人，J、”7PrimerSequence15’to3’)AnnealingtempFragment3‘zeRI：CAAACCTTITCCGCAAACCF2-CCCTTCATCGGIGGTAACTT50)川R2：GTGGCCACCACICCCGrGCC表5-2贾第虫GDH基因引物Table5-2GDHprimersofGiardia5to3P引物名称引物序列(’’)片段天，j、LbJPrimerNamePrimerSequence(5’to3’)FragmentSIZe—PrimaryGDIII(F)ATCTTCG—A—G—A—G—G——AT—G——C—T—T—G—A—G—————————2—3—24———一PrimarvGDHIa(F)ATCTTCGAGAAGGATGC'I、7FGAGPrimarvGDH5s(R)GGATACTTSTCCTTGAACTCSecondaryGDHeF(F)TACACGTYAAYCGYGGYTTCCGT46SecondarvGDHiR(R)GTTRrCCTrGCACATCrCC_———————————————————————————————————一表5-3PCR扩增反应体系(25}lLjTable5-3ThercactionsystemofPeRamplificationofGDH(25UL)Rea2entConcentrationVolumnoffirstPCRVolumnofsecondPCRdNIP5酶I．游tj{物下游，JI物个m清[J生[J(BSA)模板DNA灭菌双蒸水2mMeach1U·laL。。25uM25uM10mg·mL’O．150250．251216850150．25O．2521785GDH基因：第一次反应：预变性94。C，7rain；然后35个循环：94。C，lmin；55V，1min：72。C，1min；最后延伸72。C，7min。 河南农业大学博二L学位论文第五章马属动物贸第虫摹于TPI和GDH基因的种系发育分析第二次反应：首个循环条什：94。C，2rain；56℃，1rain；72。C，2rain；然后40个循环：94℃，30sec；56℃，20sec；72℃，45sec；最后延伸72℃，7min。2．5PCR产物检测贾第虫TPI基冈利GDH基冈PCR产物检测使川1．5％的琼脂糖凝胶，核酸染料为GelRedⅢ(Biotiumlnc．，Hayward，CA)。凝胶成像系统为InGeniusLHR(SynGene，UK)。DL2000Marker为TaKaRa公司产晶，购白人连(宝)生物l：群有限公司。2．6PCR产物测序以及种系发育分析马属动物贾第虫TPI基冈并IIGDH丛冈⋯性PCR产物全部剖0序，洲序公司利测序试剂参见第三章中的2．4。种系发育分析参址第三章中的2．5。3结果3．1TPI基因序列比对及种系发育分析对显微镜榆布贾第虫包囊⋯性的粪样7份和80份朱检剑包囊的6月龄以卜驴的粪样TPI基冈扩增，共扩增山TPl基冈4份。种系发育分析表明，米白j-．驴的二个样品174、186、199属丁聚集体B1V，331样品小0属]：聚集体A。见幽5一I。TPI序列比对结果发现：33l号与AB569393、HQl79652、EF654693、AY368157参考序列完全一敛，为聚集体Al：而174、186、199与米白丁-人、狒狒、废水样品的AB569404、EU637590、GU564284、AY368167、AY368169、AB480868、AY368j65一B⋯比较接近，属聚集体B。各TPI序列与相似序列的差异比较见表5．4。在162位和364何，分离样黼1J已知样品比较，由碱基G变为A，即有两个碱基的变异。表5-4驴贾第虫TPI序列差异比较Table5-4ThedifferenceofGiardiaisolatedfromdonkey53 河南农业大学博一I：学位论文第五章马属动物贸第虫纂于TPI和GDH基因的种系发育分析stineanHf}册图5-i基于TPI基因Neighbml州‘1ining法(Kimura2-parameter模型)构建的驴贾第虫种系发育关系进化树Figure5·lEvolutionar)relationshipsamongGiardiainferredbjneighbou叫oininganalysis(usingKimura2-parametermodel)OilTPInucleolidesequencesofdonke5图5．2部分样品GDH基因扩增产物电泳结果Figure3-2ThePCRamplificationofpartialCryptosporidiumisolatesofGDHgene3．2GDH基因序列比对及种系发育分析基丁．GDH基{灭】的扩增共扩增出7个样品(见图5．2)，序列比对结果发现，本次所扩的7个样品的贾第虫GDH基冈序列与米白巴两人的EF507672完全一致，属丁．弧型BIV。禾1TPI基冈扩增结果比较，二者对同一个样品的基冈型鉴定结果一致，即174、186、199在两个位点的鉴定均为聚集体BIV。种系发育分析表明这7个样品都属丁．聚集体B类ⅣⅡ家族。结 河南农业人学博士学位论文第五章马属动物贾第虫基于TPI和GDH基因的种系发育分析果见图5．3．3．3驴贾第虫优势种类基丁两个基因位点TPI和GDH扩增山贾第虫⋯性样品8个，105、174、186、188、199、S】07、S125均来白6月龄以卜聊、驹粪便样品，表明在驴的幼龄阶段对贾第虫易感性强。在8个样品中，有7个属丁．聚集体BⅣ，一个属丁|聚集体A．1。两个Ⅱ艰均具人兽共患性。h————_O．01图5-3基于GDH基因Neighbou—oining法(Kimura2-parameter模型)构建的驴贾第虫种系发育进化树Figure5-3EvolutionaryrelationshipsamongGiardiainferredbynei曲bou—oini哩analysis(usingKimura2-parametermodel)onGDHnucleotidesequencesofdonkey3．4驴贾第虫年龄和地域分布从镜检结果利核酸扩增的刚性样品米看，所有冈|性均米白山尔济。j：市的6月龄以卜的驴驹粪样。说明以6月龄以卜-的幼龄驴对贾第虫易感。结合第一章的肠道寄生虫调夯，成年驴中没有检到贾第虫包囊。4讨论4．1马属动物贾第虫流行情况马属动物贾第虫报道的流行率从O-25％不等1134-135,1371，本次调查中共发现贾第虫显微镜 河南农业大学博上t学位论文第五章马属动物贸第虫基于TPl和GDH基凶的种系发育分析检⋯性样晶7份，基冈扩增结果也为7个I；I1性样品。从检测的样-u1总量看，本次调查贾第虫的总感染率仅为0．5％，从扩增样『}i!l总量看也只-fl8．04％，感染率不高。经分子鉴定，发现这些同1性贾第虫株都是人兽共患种类。在已经报道的马属动物贾第虫种类中，以聚集体E、聚集体A、聚集体B为主[¨81，其中以聚集体E最为常见，111"剑马贾第虫基冈型的三分之二，往意人利马贤第虫训『究发现20份样品全部属了i聚集体E。各种动物贾第虫种类和基冈型见表5—6【|481。在本研究中，共发现两种基冈珥9：聚集体B$11聚集体A，这两种基冈型同时也是人贾第虫病的土要病原。本71欠调布没有发现驴或马的聚集体E型贾第虫。在刚性样tul巾，聚集体B为优势基冈璎，这和在美国进行的马贾第虫的分子流行病学凋布结果类似：Yraubll371从纽约州lO匹马利澳人利弧帕部的2匹马中分离剑贾第虫，经SSU．rDNA分析，有8个属丁聚集体B，3个属丁．聚集体A，1个属丁聚集体E，TPI基冈分析发现．3个属丁I聚集体Al弧型，另外两个属丁聚集体A11亚喇。水白纽约州的4匹马的分离物属丁宿主特异性弧刑BlV。在扩增山目的基冈的8个样nrLI一中全部米ILl3-7月龄驴驹，成年驴或马没有发现贾第虫⋯性样品。结果址表5．5。聚集体B；fIIA基闪弧犁在人贾第虫感染中都川I有亚要地何，其中聚集体A^I39．4％，而聚集体BIll57．3％。我国人贾第虫基丁GDH摹W分)弘凋商结果发现：住12个⋯性样品中，有8个属丁‘AI，44"属J：AllⅡ州119710另一个人贾第虫病例研究中8个贾第虫样品中有4个为聚集体A，4个为聚集体BI|州J。表明在我国，屿属动物贾第虫羊¨人贾第虫有共患基冈型。两1此，马属动物虽然感染率低，感染强度不人，住动物本身?f不见临床症状，但作为储存者和携带者在人贾第虫感染中所扮演的角色却1j容忽视。表5-5马属动物贾第虫基因／亚型分型Table5-5Genotype／subgenotypeofGiardiaofequus4．2驴贾第虫和隐孢子虫流行种类的独特性本次涉及甘肃、四川、河南、山尔、内蒙占五省区码属动物尤其是驴进行的隐孢子虫和贾第虫分子流行病学调商发现，驴隐孢子虫和贾第虫的流行有不同丁-其他国家的独特特56 河南农业火学博士学位论文第五章马属动物贾第虫基十TPI和GDH基凶的种系发育分析点，首先隐孢子虫以donkeygenotypeiIl‘绝对优势种类，而这个种类在其他马属动物隐孢子虫流行病学报道中没发现。在1F优势种类的C．pravumⅡ型中，首次在马属动物中发现IldAl9GI弧犁。驴贾第虫的流行病学调夯除了有和其他报道相似之处比如幼龄动物易感，均有人兽共患种类聚集体A和B山现，驴贾第虫以聚集体BⅣ为优势弧玎4家族，只在l／7的样品中发现聚集体Al弧型。而本次凋查朱发现其他报道的优势基冈型聚集体E。驴隐孢子虫平¨贾第虫流行独彳『特征的原冈值得探讨。我国的家驴，是公元前数千年以前，由Ⅱ洲野驴驯化而米。公元前4000年左右殷商铜器时代，新疆莎车一带已开始驯养驴，并繁殖其另S种。白秦代开始逐渐由我国曲，IL及印度进人内地，当作稀贵家畜。约在公元前200年汉代以后，就有人批驴、骡南柏，IL进人陕曲、甘肃及中原I』=J地，作役畜使川。近年米，随着生产力的发展，驴有主要役使作_L}j变为肉川和约_L}j(熬制阿胶)。即使这样，驴的养殖并未能像奶牛、猪、鸡一样得到J’‘泛的集约化养殖年¨国外良种的引进，除了我国有不同的地方品种外，没有发现从国外引进洋驴的记录剃报道。IJ,I止L，住家养动物中，驴是最凡本十化家畜。可能止冈如此，才使得我国北方瑚、具有和国外马属动物不同的隐孢子虫和贾第虫流行种类分布。表5—6贾第虫在动物中的感染率和基因型【⋯8】Table5-6Giardiaduodenalisinfectionratesandgenotypeinanimals【148 }iIJ南农业人学博一卜学位论文第五章马属动物赀第虫基于TPI和GDH基斟的种系发育分析4．3驴隐孢子虫和贾第虫人兽共患风险分析Wang等(2011)1197]对河南省人的贤第虫的TPI基冈序列分析发现，人的主要寄生种类J,JassemblagesA、B，其中12个聚集体A中8个属丁A—l弧家族，4个属丁．A—II，6聚集体B为不同的新Ⅱ型，此次阔布的马属动物的贾第虫弧丌!中就有A一1Ⅱ犁存在，也有聚集体B基冈叶9。虽然本次凋夯发现马属动物的隐孢子虫平¨贾第虫有独特的种类，但这些科t类并彳i是马属动物所独有的，恰好相反，我国马属动物的隐孢r虫和贾第虫种类多为人兽共患种类。见表5．7。W此，马属动物尤其是驴在隐孢子和贾第虫流行防控中是个不可忽视的动物种类。这两种原虫在驴上感染率虽然不高，虫荷数或者感染强度比较低，使得幼龄动物如本次采样的3-6月龄的码驹不节现临床症状，由丁隐孢『-虫的生活史特点，它可能使动物处J：K期带虫和间歇排虫的状态f“J。带有隐孢子虫和贾第虫的动物iU能是人和研：境寄生虫的f弓染源，jI-L外，这些马属动物的粪便作为十壤的肥利也增加了；弓染水源利食物的机会，可能间接传播给人类。表5—7本研究鉴定隐孢子虫和贾第虫种类及人兽共患性Table5-7Speciesandit'szoonolicof’(、O'ptospoJlidiumandGmrdiainthisstud,,58 iIl『南农业大学博』j学位论文结论结论1．本研究发现我国五省区马属动物肠道寄生虫感染总卧性率70．74％(921／1302)，马属动物肠道寄生虫感染仍比较普遍。其中幼龄动物感染率较高，集约养殖的驴比散养驴感染率高。隐孢子虫感染强度普遍较低。2．首次对驴隐孢子虫进行流行病学洞布及基冈／Ⅱ11进行鉴定。在我国部分地区饲养的马属动物中鉴定山6种隐孢子虫虫种／基冈型，优势种类／基冈刑为donkeygenotype，4i同年龄段的驴均感染('．parvum，马仪鉴定出('．paJ。vⅢ”。3．基1-gp60基冈对马属动物的隐孢子进行基冈弧)职鉴定，发现两个Ⅱ型利一个新的弧家族XII，horsegenotype家族Vl中两个样品均是VIAl1G3弧珥!，lid亚家族中两个样晶均属lldAl9G1，在新家族中，XIIAl6G1弧型为优势ilF珥!。新基冈型donkeygenotype生物。7特性和公共下生意义有待丁．进一步研究和探索。4．基y-TPI+IIGDH基冈对马属动物的贾第虫的鉴定和种系发育分析表明，两个基冈位点分析的共8个贾第虫样品均属丁人兽共患的聚集体AI、BIV，这利国外报道的马的贾第虫主要种类为聚集体E有明显著别。5．马属动物的隐孢子虫和贾第虫流行种类多为人兽共患种类／基冈型，做为人隐孢子虫祠贾第虫的贮存宿主和传橘者，马属动物的作州不可忽视。59 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河南农业大学博上学位论文致谢致谢时光如梭，岁月如流。从2008年开始攻读博十学位，至今己四年。回顾这一路走来的四年，感慨颇多：因为心有所求，所以读了博士；因为在职上学，有时身不由己；因为年届不惑，又有老牛白知夕阳晚，不用扬鞭自奋蹄的执着和无奈；因为有工作、家庭事务和扶老携幼的责任在身，时有分身乏术的焦灼和隐痛⋯⋯但是，这就是真实的生活，不管是压力还是动力，有老师、同事、家人、朋友、同学的一路支持、鼓励、关怀，我依然稳步前行，收获了知识、智慧、欢乐、喜悦、温馨和幸福。在我一路走来的几年，忘小了人和事时时温暖着我、鞭策着我，让我感念在心：我的恩师张龙现教授治学严谨、孜孜追求、不懈探索，在学业上、科研上给予我及时的引导，他高尚的人格、宽大的胸怀、为人师表的风范让我受益终生。我的老师宁长申教授工作兢兢业业、生活克勤克俭、为人谦和热情，在学习、工作上给我细心周到的指导，在考博、论文撰写期问为我分担工作任务以便我能潜心复习和撰写论文。这些点点滴滴的支持和帮助成为我i，J．进的动力。感谢导师组崔保安教授、王川庆教授、张改平院士、杨国宇教授、胡功政教授、夏平安教授在我学习、工作上给与的指导和帮助!我的师姐张素梅副教授、同学赵金凤老师无论在生活上还是工作上都给予我莫大的帮助和支持，我的师弟王荣军博士在沦义试验等方面给了我及时的帮助，师弟董海聚博士、李国权博士、我的同事张红英副教授、赵青玉老师、刘红英老师、吴华老师在日常工作和生活中是我的好同事好姊妹，感谢你们“|18j的支持和帮助!感谢动物医学系的王亚斌副教授、贺秀媛副教授、邓立新副教授、陈红英副教授、魏占勇副教授、杨霞副教授、王彦斌副教授、杨明J、L副教授、王学兵副教授、土新卫副教授、张志平副教授、张君涛老师、仝宗喜副教授等同事在学习和工作上给予的支持和帮助。感谢牧医工程学院程功鹏书记、张红阳副书记、牛娟副书记、康相涛教授、李明副院长、李奎副院长、卢红振老师、来卓老师、余果老师等及其他领导和同事的关怀与支持；感谢领导和同事们共同缔造的良好环境，使我不断获得大家的 河南农业大学博上学位论文致谢支持和帮助。感谢研究生处杨秋生处长、李为处长以及郝四平老师、李红娟老师、我院高保健、周彦等老师在我完成学业过程中给与帮助!感谢美国疾病控制和预防中心围家人兽共患病。}t心分子寄生虫学研究室主任、著名寄生虫学家肖立华(LihuaXiao)教授热情的指导和帮助!感谢内蒙古农大杨晓野老师、青海畜科院蔡进忠老师在采样时给予的大力帮助，感谢沁阳驴交易市场、泌阳驴驿康保种场、山东济宁、嘉祥等马属动物养殖场等单位的在采样时的大力支持!感谢实验室齐萌、黄磊、史亚东、赵子方、朱丹、李梦婕、宋丹、杜海利同学在我试验期问的支持和帮助!特别感i身}我的父母多年来为我的默默奉献和无私付出!感谢我的姐姐们和弟弟、弟妹在生活上对我的关心，精神上的鼓励!特别感谢我的儿子肖鹤鸣对我的理解、支持和贴心的帮助!感谢我的爱人肖乃淼的理解和大力支持，感谢婆家亲人给我的精神鼓励和支持!最后，感谢所有未能提及的给我帮助的人!菅复春2012年5月20号 河南农业大学博上学位论文作者简介菅复春，女，汉族，1971年10月出生，河南省永城市人，中共党员。1989年考入河南农业人学牧医l：程学院兽医甲检专业学习，1993年7月毕业留校，从事禽病防治和生物制晶研究。2002年9月，考取河南农业人学牧医r科学院预防兽医学全日制硕十研究生，2005年7月毕业获得硕十学位后从事兽医寄生虫相关教学科研1．作。2008年9月，考取河南农业人学预防兽医学博+研究生，师从张龙现教授，研究方向为人兽共患病原生物学。先后获准土持国家白然基金面上项目1项，省、厅级项目5项，参研国家、省部级科研项目十余项；获得省科技进步一等奖、二等奖各l项，专利4项；主编、参编并作7部，第1、2或通讯作者发表SCI、核心期刊论文38篇。为此曾获“郑州市优秀女科技1．1乍者”荣誉奖励。多次获得河南农业人学优秀班主任、优秀教师、IIJ帼标兵、招生就业先进个人等荣誉奖励。博士期间已发表和待发表的主要论文：I、SumeiZhang，FuchunJian，GuanghuiZhao，LeiHuang，LongxianZhang，ChangshenNing。RonNunWang．MengQi，LihuaXiao．Chickembryotrachealorgan：AnewandeffectiveinvitroculturemodelforCryptospo州iLIlllbaileyi．．VetParasit01．(20l2)，http：／／dx．doi．org／10．1016／j．vetpan2012．03．049。苫’复春共同第一作者；2、鸭源贝氏隐孢子虫对鸡的致病性研究《中国兽医学报》录用(2012年第8期刊山)，营复春通讯作者3、微小隐孢子虫LAMP检测方法的探索《人兽共患病学报》录用，史亚东第1作者，菅复春通讯作者4、PrevalenceandfirstmultilocusgenticanalysisofCryptosporidiumspp．indogsinChina，{}{I￡稿((ParasitologyInternational))菅复春第1作者，张龙现通讯作者5、WangR，JianF，SunY’HuQ，ZhuJ，WangRNingC，ZhangL，XiaoL．Large-scalesurveyofCryptosporidiumspp．inchickensandPekinducksUnuspIntyrhynchos、inHenan，China：prevalenceandmolecularcharacterization．AvianPath01．20l0．39(6)：447—51．(第二作者)6、KeShi5--FuchunJian，ChaochaoLv,ChangshenNing，LongxianZhang，XupengRen，TheresaK．Dearen，NaLi，MengQi，andLihuaXiaoPrevalence，GeneticCharacteristics，andZoonoticPotentialofCryptosporidiumSpeciesCausingInfectionsinFarmRabbitsinChina．JournalofClinicalMicrobiology,2010，48(9)：3263-3266(第二作者)7、姚慧霞，齐萌，史Ⅱ东，菅复春(通讯作者)。某鸽场暴发蛔虫病的诊治，中国备牧兽医，2011．38(3)：211-2138、赵金风，营复春，!卜K中，张龙现．《兽医寄生虫学》教学方法概述，河南蕾牧兽医，201】，32(1)：9．1177 i"l南农业大学博一Ij学位论文作者简介9、赵金风，菅复春，张素梅，张15松，张龙现．动物医学国家级特色专业的建设与实践，江两农业学报，2011，23(2)：174．17710、菅复春，宁K中，张龙现，羊寄生虫病防控措施(夏季羊病防制专家谈)．农村养殖技术，201I，10：23—2411、菅复春，‘r长中，张龙现，张素梅，千学兵．羊春季常发寄生虫病有哪些．农村养殖技术，2011，2：30．3112、赵余风，党海亮、何国卢，菅复春(通讯作者)，张龙现。无步蛇源隐孢子虫分离株的分子鉴定．曲北农林科技人学学报(白然科学版)，2011，39(6)：20．2413、营复春，张龙现，’rK中．千寄生虫病防控措施(秋季羊病防制专家谈)，农村养殖技术，2011，17：23，2414、菅复春．准确定位，明晰目1；_：|。⋯人学生毕业实习环1，教与学的思考．教育教学论坛，2011．32：35—36，jJ‘Lml：CN13，1399／G4．ISSN1674—932415、杨红玉，梁楠，张素梅，菅复春(通讯作者)，张龙现，。j：K中．抗安氏隐孢子虫单克隆抗体的制器与鉴定【J]．河南农业人学学报，2010(1)：65—68．16、梁楠，菅复春(通讯作者)．李家诚，仇{0兴，张龙现．乳牛源隐孢子虫种类的PCR—RFLP和分子种系发育分析鉴定，中国兽医科学，2009．3l(1)：22～2817、董剐平，菅复春，张龙现，。jJ艮中．犬隐孢子虫和隐孢子虫病研究进展，热带医学杂忠，2009，9(1)：99～10318、胡群III，菅复春，。j。K中，张龙现．隐孢子虫分类研究进展，中困病原生物学杂志，2009，4(3)：226．23l19、杨红下，菅复春，张素梅，张龙现，隐孢子虫免!f芟学检测方法研究进展，国际医学寄生虫病杂，占，2009，36(3)：178—182博士期间著作：1、参编《动物寄生虫病学》，主编：秦建华，张龙现．河北人L屯山版社，2008参编：菅复春(第八章第_二、三1，从73—130页共68页4．4万字)2、参编《兽医寄生虫学》(“十一五”规划教材)，主编米铭忻，张龙现科学山版社，20093、主编《鸭鹅场多发疾病防控手册》，河南科技山版社，刊号：ISBN978．7．5349．4654．7，2011山版4、主编《猪场疾病疑难解析》，中原农l心出版社，2012刊⋯中。2009年来主持项目1、国家自然科学基金面上项目(31172311)：新发人兽共患虫种～兔隐孢子虫宿主适戍性遗传基础研究(2011)78 河南农业大学博士学位论文作者简介2、河南省教育厅科学技术研究重点项目(12A230006)：河南省蜱种类及其携带主要病原研究(2012)3、国家科技支撑计划重点项目子课题(2009BADB4800)：动物疫苗耐热保护剂及冻干技术研究与开发(2009)4、省科技公关项目：动物隐孢子虫免疫荧光(IFA)及环媒恒温扩增(LAMP)检测技术的建立及戍川(2008)5、校艮创新基金：人源隐孢子虫分离株群体遗传结构及优势基冈孤型致病性差异的分子基础(2009)6、科泞及适刖技术传播I．程项目(093400410070)：规模养猪、养鸡、养鸭技术推J、(2009)