体外研究慢病毒载体介导人dnmt1基因对sle患者cd4+t淋巴细胞的作用

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1、复旦大学博士学位论文体外研究慢病毒载体介导人DNMT1基因对SLE患者CD4+T淋巴细胞的作用姓名：梁俊申请学位级别：博士专业：皮肤病与性病学指导教师：徐金华2012-03复旦大学博士研究生毕业论文第一部分：中文摘要SLE患者与正常人CD4+T淋巴细胞DNMTlmRNA的表达目的：探讨DNMTlmRNA在SLE患者与正常人CD4+T淋巴细胞中的表达及与自身免疫反应的关系。方法：采用RealtimeRT-PCR方法检测30例SLE患者与18例正常人CD4+T淋巴细胞DNMTl的mRNA表达水平，同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平，

2、分析二者之间的相关性及其与疾病活动性评分(SLEDAI)的相关性。结果：与正常人比较，SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMTlmRNA表达水平明显降低(P<0．05)，细胞基因组DNA总体甲基化水平显著降低(P<0．05)，SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMTlmRNA的表达水平与细胞基因组DNA总体甲基化水平呈显著正相关(r=0．476，P<0．01)，细胞基因组DNA总体甲基化水平与SLE．DAI成负相关(r=一0．45，P<0．05)，而SLE患者DNMTlmRNA的表达水平与SLE．DAI的相关性不明显(r=一0．196，

3、P>0．05)。结论：SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMTlmRNA表达水平的下降，且DNA低甲基化关联，在SLE发病机制中起重要作用。关键词：DNMTl；SLE；CD4+T淋巴细胞；甲基化；自身免疫中图分类号：R75第二部分重组人DNMTl慢病毒载体的构建和病毒包装目的：构建重组人DNMTl慢病毒载体并进行包装。方法：人DNMTl基因片段经PCR扩增后，与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接，获得pLenti6．3／V5一DNMTl表达质粒，转化细菌感受态细胞，克隆菌落行PCR鉴定，对阳性的重组质粒进行测序；将重组质粒与慢病毒包装

4、系统同转染293FT细胞进行病毒包装，Realtime定量PCR法检测病毒滴度。结果：DNA测序结果证实成功构建人DNMTl重组慢病毒载体，对其进行包装后测定慢病毒滴度为3．13"1010copies／ml。结论：成功构建并包装人DNMTl重组慢病毒表达载体。关键词：人DNA甲基转移酶1；慢病毒载体；病毒滴度中图分类号：R75复旦大学博士研究生毕业论文第三部分体外研究pLenti6．3／V5-DNMTl质粒对SLE患者CD4+T细胞的作用目的：体外研究pLenti6．3／V5．DNMTl质粒对SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的作用

5、。方法：将pLenti6．3／V5．DNMTl质粒和pLenti6．3／V5．GW／LacZ(对照质粒)分别侵染SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞，运用qPCR，Westernblotting，流式细胞仪和ELISA分别检测SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的DNMTl基因表达，DNMTl蛋白水平，细胞基因组DNA总体甲基化状态和IgG抗体产量。结果：转染pLenti6．3／V5．DNMTl质粒后，SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的DNMTl基因表达水平明显提高，DNMTl蛋白水平明显增加，细胞基因组DNA总体甲基化状态提升并减少

6、IgG抗体的产生。结论：过表达DNMTl能逆转SLE患者CD4+T细胞的异常低甲基化作用，抑制自身免疫反应。关键词：pLemi6．3／V5．DNMTl；SLE；CD4+T淋巴细胞：甲基化：自身反应中图分类号：R754复旦大学博士研究生毕业论文AbstractPartIExpressionofDNMTImRNAinCD4+Tcellwithsystemiclupuserythematosusandnormalcontrolsobiective：TostudytheexpressionofDNMT1mRNAinCD4+Tcellwith

7、systemiclupuserythematosus．Methods：Peripheralbloodmononuclearcells(PBMCs)from30SLEpatientsand18healthycontrolswereisolatedbyFicoll—Hypaquedensitygradiemcentrifugation，CD4+subsetswereisolatedbypositiveselectionusingMiltenyibeads．ExpressionofDNMTlmRNAinCD4+Tcellswasanaly

8、sedbyRealtimeRr-PCR．theglobalDNAmethylationlevelwasdetectedbytheMethylFlashTMMethylatedDNAQuantificationKit(Colorimet