慢病毒载体介导的shrna对小鼠t细胞cd28基因表达的影响

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1、慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响作者：程娜娜，桑威，陈翀，徐开林【摘要】目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列，亚克隆入慢病毒载体pLB中，构建出重组慢病毒干扰质粒，行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞，实时荧光定量RT

2、-PCR和ethodsThreepairsofspecificinterferencesequencestargetingCD28geneandonepairofnon-specificRNAinterferencesequencesofU6promoter,soastoconstructfourrebinantplasmids.293FTcellsidandtids,andthelentivirustiterinedaccordingtotheexpressionlevelofgreenfluorescentprotEin(GFP).Mousesp

3、leenlymphocytesRNAtranscriptionandprotEInexpressionofthesecellseRT-PCRandVΔ8.91及包膜蛋白质粒pMD.G为本实验室保存。限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶购自美国Neine2000购自Invitrogen公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Promega公司。抗小鼠CD28单克隆抗体购自SantacruzBiotechnology，碱性磷酸酶标记山羊抗大鼠IgG购自北京中杉金桥公司。Purifiedanti-mouseCD3ε购自Biolegend公司。聚凝胺

4、购自德国Fluka公司。鼠IL-2购自美国RD公司。小鼠CD28基因荧光定量PCR试剂盒购自广州达晖生物有限公司。　　1.2方法　　1.2.1双链DNA的设计及合成根据Genebank公布的小鼠CD28基因的序列(NM007642)，设计3对shRNA干扰序列及1对非特异性干扰序列(表1)。经BLAST同源性检索确认与CD28以外的小鼠已知基因序列无同源性。每条OligoDNA由19nt的寡核苷酸序列以正反向组合，中间添加Loop结构(TTCAAGAGA)，使寡核苷酸可以形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有HpaⅠ和XhoⅠ酶切位点，转录终止信号(

5、TTTTTT)位于OligoDNA3′末端。以上OligoDNA由Invitrogen公司合成。表1插入慢病毒载体OligoDNA的序列　　1.2.2慢病毒载体的构建及鉴定设计并合成好的OligoDNA退火形成双链DNA，与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后胶回收的pLB线性化片段连接，连接后的重组质粒命名为pLB-CD28/shRNA，包括特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA1、2、3和非特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA4。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增并予琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物根据PrimerPremier5.0软件设计，上

6、游引物:5′-AAAGGAAACTCACCCTAACTGT-3′，下游引物:5′-TGGAATCTCGTGAAGCGAG-3′。预期片段大小为171bp，挑选PCR鉴定与预期相符的重组阳性克隆菌液送Invitrogen公司进一步测序鉴定。　　1.2.3慢病毒载体的包装及滴度测定将包装细胞293FT细胞接种于10cm培养皿，采用Lipofectamine2000将pLB-CD28/shRNA、pCMVΔ8.91、pMD.G三质粒进行共转染，转染后24、48h用荧光显微镜观察转染效率。收集48、72h病毒上清，4℃70000g离心2h，分装后置-80℃保

7、存。采用有限稀释法荧光显微镜下观察GFP表达并计算病毒滴度，公式为：病毒滴度=(GFP阳性细胞个数×稀释倍数)/ml。　　1.2.4慢病毒感染脾细胞并分选GFP阳性细胞取C57BL/6小鼠脾脏单个核细胞，制成细胞密度为1.5×109/L的细胞悬液，在含10%FBS的RPMI1640培养基(含rhIL-21×105U/L、anti-mouseCD3ε5mg/L)中培养24h，以感染复数(MOI)为5的病毒浓缩液感染脾细胞，同时加入终浓度为8mg/L的聚凝胺及5×104U/L的rhIL-2，37℃1200r/min离心90min。感染6h后换液，72h荧

8、光显微镜下观察感染情况。应用荧光激活的细胞分选技术(FACS)分选GFP阳性细胞，置-80℃冰箱保存。　　1