转猪pgc-1α基因小鼠的制备

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1、华中农业大学硕士学位论文转猪PGC--1α基因小鼠的制备姓名：王单申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：雷明刚201206转猪PGC．1a基因小鼠的制备摘要肌纤维类型是影响猪肉品质的重要因素，但是通过传统的杂交育种方法来改变猪肌纤维的类型时问过长。然而转基因技术的出现，提供了一种快速改变动物遗传信息并获得新表型的方法，成为育种的新方法。本研究选择猪PGC．1a这一与肌纤维转化相关的基因用于制备表达PGC．1a的转基因小鼠，为转基因猪的制备提供理论依据。首先，利用NCBI查询猪PGC．1仪基因的mRNA序列，在起始密码子前添加SalI酶切位点，在终止密码子

2、后添加NotI酶切位点，然后合成eDNA序列，并将其克隆进pCAGGS—neo真核表达载体，利用脂质体的方法转染小鼠的C2C12细胞，通过RT-PCR能够检测到PGC．1a在小鼠C2C12细胞中得到广泛表达。利用合成的PGC．1a全长eDNA序列构建了转基因载体pCAGGS．PGC．10【．neo，用于转基因小鼠的制备。通过显微注射的方法制备pCAGGS．PGC．1a．neo转基因小鼠，PCR检测证实22只pCAGGS．PGC．1a．neo转基因小鼠的基因组中整合有转入基因，转基因阳性率为29．73％，选取founder鼠与野生型C57BL／6J小鼠交配传代，建立相应

3、的转基因小鼠系。对转基因小鼠系中外源性PGC．10【表达进行鉴定，首先提取转基因小鼠肌肉组织的总RNA，进行了RT-PCR的检测，结果表明pCAGGS．PGC．1a．neo转基因小鼠的肌肉组织中有PGC．1a的转录。然后分别提取pCAGGS—PGC．1tt．neo转基因小鼠和野生型小鼠的肌肉组织总蛋白，用PGC—la的多克隆抗体做Westernblot，结果在转基因小鼠的肌肉组织中检测到有更多PGC．1Qt的表达。通过肉眼对肌肉的生态学观察，转基因小鼠的大部分肌纤维呈现出氧化型肌纤维发红的特性，而同窝的非转基因小鼠的肌纤维在外观上是苍白的。用小鼠肌肉组织制作石蜡组织切

4、片，对转基因小鼠和非转基因小鼠的肌纤维进行HE染色，通过观察肌纤维的形态，可以看出：转基因小鼠含有部分的I型肌纤维，而在非转基因小鼠中几乎都是II型肌纤维。这些结果表明PGC．1a的超表达能够促使小鼠肌肉的II型肌纤维向I型肌纤维转化。关键词：肌纤维；PGC．1a；转基因小鼠；C2C12细胞华中农业大学2012届硕士学位论文AbstractAsanimportantobjectiveofpigbreeding，meatqualityhasbeenpaidmoreandmoreattentionbypigbreedersandconsumersinrecentyears

5、．MuslefibretypeisanimportantfactorinfluencingmeatqualityandPGC—laplaysapivotalroleinmusclefiberspecialization．However,forpigbreeding，itistoodifficulttochangepigmuslefibretypeconstructionbytraditionalbreedingmethods，suchashybridizationandselection．Transgenetictechnology,thatcanchangegene

6、ticinformation，providesanewchoiceforpigbreeding．Inthisstudy,toobtainusefulinformationforpreparationoftransgenicpigwhichcarryingthegeneofpigPGC—la，transgenicmicethatexpresspigPGC—lawereestablishedtoinvestigatetheinfluenceoftransgeneticPGC—lagenetomuslefibretype．First，theeDNAsequencecodin

7、gforpigPGC-lafromNCBIdatabaseWaSsyntheticed．Inthesequencesynthesis，aSalIrestrictionsitesequencewasaddedbeforestartcodonandaNotIrestrictionenzymesequencesiteWSaddedbehindterminationcodon．ThenthePGC—lagenewithSalIrestrictionandNotIrestrictionwasclonedintoaeukaryoticexpressionvect