精子介导转cd59和mcp双基因小鼠和猪的研究

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1、Y977730分类号：塾!g!gUDC：墨!!尘!!密缴：公Ⅱ学校代码：10712研究生学号：S03290西北农林针杖大学2006届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文精子介导转CD59和MCP双基因小鼠和猪的研究学科专业研究方向研究生指导教师完成时间筮直生塑堂堕塾动堑筮直生麴王翟一凿红卫毖涌煎攫至鱼Q鱼生鱼旦中国陕西杨凌精子介导转0D59和MCP双基因小鼠和猪的研究摘要本研究在分别构建了表达人膜反应性溶解抑制物(CD59)基因的重组载体pEGFPNI-CD59、表达人膜辅蛋白(MCP)基因的重组载体pEGFP

2、NI-MCP后，利用精子介导法生产转CD59和MCP双基因小鼠，并采用PCR检测其结果。利用PCR、心脏灌注和RT-PCR检测转基因小鼠与非转基因小鼠交配后所生的后代。此外，还利用精子介导法生产转pcDNA3．CD59、pcDNA3一MCP双基因猪，所得结果如下：1．将pcDNA3一CD59、pcDNA3一MCP质粒分别用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切，获得的目的片断与线性化的pEGFPNl质粒连接，成功构建重组载体pEGFPNI-CD59、pEGFPm—MCP。2．将分别含CD59基因和MCP基因的表

3、达载体与脂质体混合制成基因．脂质体复合物，分别采用睾丸注射、输精管注射和精子／基因．脂质体复合物共孵育三种方法生产转双基因小鼠。其中睾丸注射法、输精管注射法和外源基因／精子共孵育法分别各处理公鼠5只，7d后各配母鼠25只，结果分别冲出胚胎793枚、810枚和357枚，荧光显微镜下检测到荧光的分别有81枚胚胎(10．2％)、75枚胚胎(9．26％)和53枚胚胎(14．9％)。PCR检测得到的胚胎，发现表达绿色荧光蛋白的胚胎其PCR反应阳性率为100％，说明外源基因在胚胎发育早期可以表达。3．利用构建成功的转CD

4、59+MCP双基因小鼠与非转基因小鼠交配，PCR检测所生的后代(34只)，发现CD59基因阳性的有14只(41．2％)，MCP基因阳性的有12只(35．3％)，CD59+MCP双基因阳性的有8只(23．5％)。通过用人血清灌注小鼠心脏，发现转基因小鼠心跳时间明显比非转基因小鼠心跳时间长，差异显著(P<0．05)。RT-PCR检测转基因的表达情况，发现在转基因小鼠的心脏组织中有CD59基因、MCP基因的表达。4．将CD59和MCP基因与脂质体混合制成基因．脂质体复合物，分别采用睾丸注射、输精管注射和精子／基因．

5、脂质体复合物共孵育三种方法来生产转双基因猪。其中睾丸注射法处理公猪l头，44d后配母猪8头，7头受孕，产仔73头，结果检测到PCR阳性猪3头(阳性率4．3％)；输精管注射法处理公猪3头，8d后配母猪3头，0头受孕；外源基因，精子共孵育法处理公猪4头，处理母猪4头，1头受孕，产仔11头，结果检测到PCR阳性猪1头(阳性率9％)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪，经PCR初步检测，其中4只仔猪为转基因阳性，阳性率(4．8％)。关键词：精子介导：CD59；MCP：转基因小鼠：转基因猪THESTUDYOFCD59AN

6、DMCPGENETRANSGENICMoUSEANDSWINEBYSPERM．MEDIATEDGENETRANSFERABSTRACTOnthebaseoftheconstructionofrecombinanthumanCD59proteinexpressionplasmidspEGFPm—CD59andhumanmembranecofactorprotein(MCP)expressionplasmidspEGFPm—MCP,thetransgenicmicewereproducedbysperm—medi

7、atedgenetransfer．AndtheoffspringsweredetectedbyPCR，theperfusionintoheartandRT-PCRiThetransgenicpigswereproducedbythismethod．Resultswereasfollows：1．TheplasmidpcDNA3·CD59、pcDNA3一MCPweredigestedbyEcoRIandKpnI．ThefragmentswereconnectedwithpEGFPm．Therecombinanth

8、umanCD59proteinexpressionplasmidspEGFPNI—CD59andhumanmembranecofactorprotein(MCP)expressionplasmidspEGFPNI·MCPwreconstructed．2．TheCD59geneandMCPgeneweremixedwitllliposome．thenusedtoproducetransgenicmic