异常细胞间通讯在白血病中作用机制的研究

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1、中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文第一部分mM．CSF介导的反向信号研究摘要细胞通讯是维持细胞生存和功能的基础，其异常与疾病密切相关，在经典单向信号传递机制的的基础上，发现并初步阐明了反向信号传递现象，其研究成为生命科学研究热点之一。In】Ⅵ．CSF是巨噬细胞集落刺激因子(M．CSF)的一种选择性剪接产物，为膜结合型细胞因子，我们前期的研究证实了它具有并置性和粘附分子样作用，与其受体结合后可能传递双向信号。本论文在我室多年研究的基础上，对mM．CSF介导的反向信号及其传递机制进行了探讨。构建了野生型和突变型Ir朴CSF的pTARGET

2、真核表达载体以及MSCv-PGK-GFP逆转录病毒载体，经DNA测序证实后分别转染、感染N锄al、Ⅳa细胞，筛选获得了稳定表达细胞株：用MSCVPGK．GFP转染HEK293细胞，获得阳性表达细胞。采用RT-PCR和W宅Stemblot方法证实上述细胞构建成功。以稳定表达野生型mM．CSF的N锄alwa细胞株以及瞬时表达mM．CSF的HEK293细胞为模型，研究mM．CSF介导的反向信号传递。可溶性受体作用后可引起胞内分子量约为40kD的蛋白酪氨酸磷酸化水平显著升高；蛋白芯片结果显示多种蛋白激酶磷酸化水平发生变化；wbstemblOt方法进一步证

3、实ERK、A虹在可溶性受体作用后磷酸化水平升高，提示mM．CSF可以介导反向信号，并且ERK、心信号途径参与该反向信号传递。以稳定表达截短突变型(胞内截短30个氨基酸残基)以及胞内三点突变型(Ser226、Ser235和11lr246均突变为舢a)111】M．CSF的N锄al、Ⅳa细胞株以及瞬时表达二者的髓lQ93细胞为模型，用同样的方法研究mM—CsF胞内区在反向信号传递中的作用。可溶性受体作用后无上述蛋白激酶磷酸化水平的改变，提示n1M-CSF胞内区，特别是胞内区的Ser226、Ser235和11lr246在反向信号传递中起关键作用。为进一步

4、探讨IIlM．CsF介导反向信号的传递机制，以稳定表达胞内区单点突变4中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文型(Ser226突变为越a)和双点突变型(Ser235和nlr246均突变为Ala)mM。CSF的N锄al、Ⅳa细胞株为模型，研究胞内区三位点各自在反向信号传递中的作用异同。初步结果显示，Ser226在反向信号传递中起重要作用。综上所述，本文深入研究了mM。CSF介导的反向信号及其传递机制；证实了nlM．CSF可以介导反向信号。首次证明了EIⅨ、心信号途径参与该反向信号传递；InM．CSF的胞内区特别是Ser226、Ser235和1

5、1lr246在介导反向信号传递中其关键作用，且作用方式存在差异，Ser226的作用更显著。关键词：111】Ⅵ．CSF，M．CSFR，突变体，ERK，从，蛋白激酶，磷酸化，反向信号5中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文PartIStudyonreversesignalingmediatedbV3tUcIV0nreVerSeSlgnanngmecllatedDVmM—CSFAbstractCellularCoI砌戚cationismefoundationofcellularsoci啊exiStS锄dru疵ng．Theabno姗ali愀llu

6、larco删c撕oniscloselyrelatedtohumandiseaSes．Thou曲claSsicalInechaIlismofinterCellularcommunicatio玛basedonone-directioIIalsi印al觚lsductioll'haSbeendeeplyinVestigatedarldtherese疵hofreVerSesignaJhaSbecomeoneofmehotpoi哟inlifesCience．111ememb啪ef0咖ofInacrophagecolony—Stimulatingfactor(

7、mM—CSF)isaIlaltematiVesplicingVariantoft11iscytol(ine．As廿leproteol如ccleaVagesitesuSedt0releaSet11eSccretedisof0HnshaVebeensplicedo吣n11讧一CSFisStablyexpressedatthecellsurface．OurpreViouSresearchshowedthatmM·CSFcouldplayjuXt；aCI．iIleandadhesionmolecule-likeroles．Itcould臼加sfer抑o-

8、direCtionalsi口alafkrbindingitsrec印teors．BaLsingonourpreVious咖diesonI