th17细胞在哮喘发病中作用机制的研究

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硕士学位论文Thl7细胞在哮喘发病中作用机制的研究专业：呼吸内科硕士研究生：龚雨新导师：于化鹏教授摘要研究背景支气管哮喘是一种以气道高反应性和慢性气道炎症为主要特征的变态反应性疾病，其发病机制尚未完全明了。较统一的观点认为哮喘是多种细胞如上皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞引起的慢性气道炎症。支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌物充满气道是哮喘患者急性发作的一个重要环节。在哮喘炎症中T淋巴细胞发挥着重要的免疫调节作用，Th2占优势的Thl／Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制，Th2细胞分泌细胞因子IL．4、IL．13、IL．5和IL．9，其中IL．4和IL一13促使B细胞生产IgE，IL·5促进骨髓嗜酸性粒细胞的分化，IL．9能趋化肥大细胞并引起肥大细胞的分化，这些细胞因子在哮喘发病中发挥重要作用。但是，这个理论并不能完全解释哮喘全部的病理生理过程。新近研究发现，机体存在一种新型的不同于1型和2型的效应T细胞一辅助性17细胞(Thelp17，Thl7)亚群。该细胞是由天然T细胞前体Th0分化而来，具有与Thl和Th2细胞不同的独立的分化和发育调节机制，其在促炎症反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。该细胞亚群能够特异性地产生效应因子白细胞介素(IL)．17，而不产生IFN吖和IL．4，因此被称为Thl7亚群。由于具有促炎性作用，也被称为炎症性T细胞(inflammatoryTcell)。Thl7细胞亚群的分化和功能均受Yhl和Th2细胞因子的调控。IL一6和转化生长因子p(TGF．p)联合作用能诱导初始T细胞分化成11117细胞，提示后者在哮喘等炎症性疾病中同样具有一定作用。IL．17A是IL．17家族的一个特殊亚型，由Thl7 中文摘要细胞亚群特异性产生，IL．17A由含有一个N．末端信号肽的155个氨基酸组成并由二硫键连接的同型二聚体糖蛋白。作为一种前炎症因子，IL．17A可以诱导气道上皮细胞及成纤维细胞增加表达多种细胞因子，如IL．6，IL．8，G—CSF，GM．CSF及粒细胞趋化蛋白．2(GCP．2)，共同催化多种炎症细胞在气道内浸润，这些细胞相互作用又可以分泌多种炎症细胞因子，构成炎症细胞及炎症因子之间的复杂网络，从而形成气道的慢性炎症。但对IL．17A及Thl7细胞在哮喘发病中作用机制的了解还不多，本研究拟通过小鼠哮喘模型观察Thl7细胞和11117细胞特异性产生的IL．17A在体内的表达情况，初步探索Thl7细胞和IL．17A在哮喘发病机制中的作用。第一部分小鼠哮喘模型的建立目的探讨建立OVA致敏和激发的BALB／c小鼠哮喘模型。方法SPF级雌性BALB／cdx鼠(南方医科大学实验动物中心)24只，4．6周龄，体重18"～209，随机分为2组，每组12只，A组为正常对照组，B组为哮喘模型组。B组小鼠于实验流程第0、14d给予腹腔注射含OVA2mg和乳化的氢氧化铝5mg的生理盐水混悬液2009l致敏；第21d开始先给予I％OVA生理盐水2009l滴鼻激发，随后给予2％OVA生理盐水雾化液40ml经超声雾化器雾化吸入，每天1次，每次持续约40min，连续6d。A组以生理盐水代替致敏液及雾化液，方法同B组。在最后一次激发1h后，摘取小鼠眼球放血后将其颈椎脱臼处死，两组小鼠各随机选取6只行支气管肺泡灌洗术。将回收的BALF涂片，固定，HE染色，光学显微镜下进行细胞总数和分类的计数。细胞分类至少计数400个细胞，求出各类细胞所占百分比。两组小鼠各各随机选取6只行开胸取肺组织，置于10％中性甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况，拍片。结果Ⅱ 硕士学位论文1．激发过程小鼠行为学观察：模型组小鼠出现不同程度的头面部瘙痒，前肢搔鼻，烦躁不安，然后俯伏不动，口唇紫绀，呼吸急促，腹肌抽搐，二便失禁等症状；而正常组小鼠无此症状。2．BALF中细胞总数和分类比较：OBALF细胞总数：A组BALF细胞总数为(0．62士0．43)x105／ml，B组BALF细胞总数为(1．414-0．13)x105／ml，B组BALF细胞总数显著高于A组(P<0．01)。(喜)BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率：A组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为O．83％_4：1．18％和5．670／'o_4：1．42％，B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为和25．42％士4．05％和29．630／'硅4．91％，B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率显著高于A组(P0．05)。哮喘模型组血浆中Thl7的水平与BALF中嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关(分别为r=0．933，P=0．007；r=0．861，P=0．028)。结论Thl7细胞参与了哮喘的发病机制，在哮喘中的作用可能是在胸腺分化成熟后，通过胸腺组织释放入外周血及其它组织中，并且外周血Thl7细胞与气道嗜酸性粒细胞及中性粒细胞呈正相关，从而参与哮喘气道炎症的发生，对哮喘发病机制进行了补充和完善。关键词小鼠哮喘白细胞介素17T淋巴细胞辅助诱导第三部分白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义目的初步探讨哮喘小鼠中血清白介素(IL)．17A的水平及在其在肺、脾及胸腺组织中的表达情况。方法28只BALB／c雌性SPF级小鼠随机分为正常对照组(A组，14只)和哮喘模型组(B组，14只)，哮喘模型的制作过程同第一部分内容。观察两IV 硕士学位论文组小鼠气道病理改变及BALF中各组细胞比例的变化；外周血通过摘眼球采取，肝素化处理，肺、脾及胸腺组织用眼科剪剪成小块后，筛网上研磨成匀浆，外周血及肺、脾、胸腺组织悬液分别置于5％的C02、374C孵育箱培养24h后，以3000r／min离心lOmin，将上清液保存在一20℃冰箱用作IL．17A的测定。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测两组小鼠血清IL．17A水平及肺、脾和胸腺组织匀浆预孵后的表达情况。结果B组BALF细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率均显著高于A组(P<0．01)。病理观察可见B组小鼠的气道炎症以中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润为主，而A组无此变化。IL一17A在A组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为10．94士5．02(xlOpg／m1)，13．63士4．07(x10pg／g)，16．37士9．85(xlOpg／g)，22．45士10．89(×lOpg／g)，IL-17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为52．23士19．08(x10pg／m1)，52．98士10．81(xlOpg／g)，54．77士10．80(xlOpg／g)，86．68士10．29(x10pg／g)。IL一17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的表达水平显著增高，与A组相比差异均有显著性意义(尸<0．01)。B组肺组织中IL．17A水平与BALF中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞呈正相关(分别为r=0．832，P=-O．040；r--0．856，P=0．030)。结论IL．17A在哮喘小鼠血清及肺、脾及胸腺组织中高表达，并且肺组织IL．17A与哮喘气道中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞呈正相关，IL．17A可能是参与支气管哮喘急性发作的主要细胞因子之一，在哮喘中的作用与其促进中性粒细胞及嗜酸性粒细胞在气道内聚集有关，从而参与哮喘气道炎症。关键词：小鼠哮喘白介素．17AThl7气道炎症V 硕士学位论文AstudyonthemechanismofThl7cellsinthepathogenesisofasthmaMajor：RespiratoryMedicineName：GoNGYu—xingSupervisor：Prof．YUHua—pengABSTRACTBackgroundBronchialasthmaischaracterizedbyairwayhyperresponsivenessandcllromcinflammation，whereasthepathogenesishasnotyetfullyunderstood．Itisgenerallybelievedthatasthmaisduotocllromcairwayinflammationinvolvingavarietyofcellssuchasepithelialcells，fibroblasts，dendriticcells，eosinophils，mastcellsandTlymphocytes．Amongthosecells，TlymphocytesaremostimportantasaTh2biasedThl／Th2imbalancehasbeenprovedtoplayacruicialroleinthepathogenesisofasthma．Th2cellssecretcytoMnesIL一4，IL-13，IL一5andIL-9，inwhichIL-4andIL-13promotesBcelltoproduceIgE；IL一5isresponsibleforbonemarroweosinophildifferentiation；IL一9attractsmastcellsandinducesmastcelldifferentiation．However，Thl／Th2imblanceCannotfullyexplainallofthemechanismsinthepathogenesisofasthma．Recently，anewThsubset(Thl7)differentfromThlandTh2Wasidentified、析t11IL一17asitssignaturecytobrle．Thl7derivesfromnaturalTcellprecursovTh0cellsandparticipatesinpro—inflammatoryresponsesandautoimmunediseases．Becauseofitsproinflammatoryrole，itisalsoknownasinflammatoryTcell．ThedifferentiationandfunctionsofThl7cellsubsetaresubjectedtotheregulationoftheThlandTh2eytokines．AcombinedtreatmentofIL一6andtransforminggrowthfactorD(TGF-13)inducesnaiveTcellstodifferentiateintoThl7cells．IL-17Aisahomodimeroftwo155aminoacidglycoproteinmonomerswithsignalpeptidesattheirN—terminalsthatalelinkedbydisulfides．Asapro—inflammatoryfactor，IL一17AinducesairwayepithelialcellsandfibroblaststoincreasetheexpressionofavarietyofcytokinessuchasIL一6，IL一8，G—CSF，GM—CSFandgranulocytechemoattractant ABSTRACTprotein-2(GCP-2)，andpromotesinfiltrationofmanyinflammatorycellsintotheairway．Theinteractionsamongthosecellsfurtherenhancethesecretionofmanymoreinflammatorycytokines．Consequently，allthoseinflammatorycellsaswellastheircytokinesconstituteacomplexnetworktoprmotechronicinflammationintherespiratorytract．DuetothelackofdetailedmechanismsofIL一17AaswellasThl7cellsinthepathogenesisofasthma,thisstudyWasdesignedtoinvestigatetheeffectofThl7cellsandIL一17Ainthemouseasthmamodelandtoexploretheirrolesinthepathogenesisofasthma．PartoneEstablishmentoftheasthmaticmousemodelobjeetiveToestablishaBALB／cmouseasthmamodelbyOVAsensitizationandre—challenge．MethodsSPFfemaleBALB／cmice(4to6weeks)，18～209，werepurchasedfromLaboratoryAnimalServicesCenterofSouthernMedicalUniversity，andmaintainedonanovalbumin—freediet．Themicewererandomlydividedinto2groups：controlgroupandasthmaticgroup．Miceweresensitizedondays0and14byallintraperitonealinjectionofamixturecontaining2mgofovalbuminand5mgofAI(OH)3insaline(atotalvolumeof0．2m1)．At21daysafterthefirstimmunizationtheanimalswerefirstlychallenged谢thintranasaldropof1％ovalbumin．thenchallengedbyexposuretoallaerosolof2％ovalbumingeneratedbyanultrasonicnebulizerfor40min．The40-minrechallengeprocedureWasrepeatedonceeachdayfromday22today26．Thecontrolanimalsweretreated、Ⅳitll5mgofAI(OH)3insalineandre-challenged、析tllsalinesolution．Theanimalswerekilledbycervicaldislocation1hafterthelastexposuretoaerosolre-challenge．Sixmicefromeachguoupweresubjectedtobronchoalveolarlavage．Thebronchoalveolarlavageswerestained、ⅣitllHEandeosinophilnumbercounted、柝thahematocytometer．Atleast400lymphocyteswerecountedbymicroscopybeforethepercentagesofvarioustypesofcellswerecalculted．Afterbronchoalveolarlavage，theanimalsweresacrificed，theirlungsharvestedandfixedin10％phosphatebufferedformalinforfurtheranalysis．Tissuesweresliced 硕士学位论文andHEstainedforhistologicalexamination,includingmorphology，epithelialinjury，perivascularandperitrachealinfiltrationofeosinophils．Results1．Thebehaviorchangesafterre-challengeMiceinasthmaticgroupdisplayedvarioustypesofallergicresponses，suchasscratchingheadandface，dyspnea,orallipcyanosis，musclespasmaswellasgatism，whilecontrolgroupshowednosuchsymptoms．2．ThechangesintotalcellsanddifferentcelltypesinBALFa．ThetotalBALFcellnumberintheasthmagroupWas1．414-0．13×105／ml，thatissignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup0．624-0．43×105／rnl(P0．05)．Intheasthmaticmice，Thl7cellsintheperipheralbloodwaspositivelycorrelated研ththepercentagesofneutrophils(r=0．933，P=0．007)andeosinophils(r=0．867，P=0．028)intheBALF．Conclusions 硕士学位论文Thl7cellsareprobablyinvolvedinthepathogenesisofasthma．Thecellsmaydifferentiateandmatureinthethymus，andthenarereleasedintotheblood．Thl7cellsinthepedpheralbloodWaspositivelycorrelated、析tllthepercentagesofneutrophilsandeosinophils，possiblerecruitingneutrophilsandeosinophilsintoairwaysandleadingtoasthmaticairwayinflammation．Keywords：mice；asthma；interleukins；T-lymphocytes，helper—inducerPartthreeExpressionofinterleukin-17AinasthmaticmiceanditssignificanceobjectiveTostudytheserumlevelofinterleukin-17A(IL-17)anditsexpressioninthelung，spleenandthymusinasthmaticmice．MethodsIIl14normalBALB／cfemalemiceand14asthmaticmice，thechangesintheairwaypathologyandthecellproportioninthebronchoalveolarlavagefluid(BALF)wereobserved．Afterbloodcollectionbyeyeextraction,lungs，spleenandthymuswereharvestedandcutintosmallpiecesandsmashedonthemeshtomakesinglecellsuspension．necellswereincubatedat37℃谢m50％C02for24handthensupernatantcollectedandstoredin-20。C．IL一17Ainselllnlandinthesupernatnatsfomlung，spleenandthymustissuesofthetwogroupsWasdeterminedbysandwichenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)．ResultsThetotalcellnumberandthepercentageofneutrophils，eosinophilsandlymphocytesinBALFoftheasthmaticmiceweresignificantlyhigherthanthatinthecontrolmice(P005Fig4ResultsofThl7cellsintheperlphera]blood，spleens，thymusandlungsof2groupsmicebyflowcytometryanalysis2．4相关性分析：哮喘模型组血浆中Thl7的水平与BALF中嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关(r=0933，P=0007；r=0861，尸=0028)。(见图5)AB冒5哮喘模型姐血泉中Th¨与队LF中嗜中性粗细胞(A)和嗜酸性拉细胞(B)的曲线估计．Fig5CorrelationsoftheIL-17Aintheperipheralbloodtoncutrophils(A)andeoslnophlls(B)htheBALFofasthmaticmice 第二部分Thl7细胞在哮喘发病中作用机制的研究3讨论支气管哮喘的病理生理改变以气道慢性非特异性炎症、气道反应性增高及气道重建为主要特征，这三者相互作用、互相影响，且均与淋巴细胞有关。T淋巴细胞是介导免疫应答的主要免疫细胞，按照其分化和功能特征可分为Thl、Th2、Thl7和调节性T细胞(regulatoryTcells，Treg)[15-17】。以往不少学者认为Thl／Th2失衡学说是哮喘免疫发病机制的主要理论，但近年来许多学者又提出了新的观点，认为Thl／Th2失衡学说过度简化了哮喘的发病机制，其依据是糖皮质激素是治疗哮喘最有效的抗炎药物，但糖皮质激素可以有效抑制细胞免疫而对体液免疫无明显影响，由于细胞免疫是Thl介导的，而体液免疫是Th2介导，所以不能将哮喘的发病机制简单的归纳为Thl／Th2平衡失调。哮喘的免疫网络具有复杂性和多重性，提示有更多的机制参与了哮喘的免疫调节。本实验将正常小鼠和哮喘小鼠的外周血、脾脏、胸腺和肺组织细胞用莫能菌素预孵，阻断特异性蛋白IL．17A的分泌，通过破膜剂使完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞，然后用荧光染料标记的单克隆抗体对细胞表面的CD4分子和细胞内IL．17A(IL．17A为Thl7细胞特异性产生的主要蛋白之一)进行标记，然后检测两组小鼠中Thl7细胞的表达情况。结果表明，与正常小鼠相比，哮喘小鼠外周血、脾脏和胸腺中Thl7细胞的表达明显增加，而局部肺组织中的Thl7细胞并无明显变化，可能跟肺脏不属于免疫器官有关，但增加样本量做进一步研究仍然很有必要。Thl7细胞能够特异性分泌IL．17A，此蛋白是属于一种独特类型的具有多种功能的细胞因子，能诱导产生不同的细胞因子及调节因子，通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症，本实验通过检测不同组织细胞内IL．17A的分布情况，证明-j'IL．17A+Thl7细胞在哮喘发病机制中的重要作用。嗜酸性粒细胞在气道内的聚集是过敏性气道炎症的特征性表现，而中性粒细胞可以使急性哮喘恶化及哮喘急性发作的症状加重，慢性重症哮喘患者(相当于重度持续的哮喘患者)的气道中也存在大量的中性粒细胞，夜间哮喘发作也 硕士学位论文与中性粒细胞增加有关。使用抗CD4抗体和抗IL．2受体的抗体均能够抑制变应原诱导的中性粒细胞在气道内募集，说明中性粒细胞在气道内的募集受某种T淋巴细胞所控制。本研究结果显示：哮喘的胸腺组织中Thl7细胞含量显著高于血浆、脾脏及肺组织中Thl7细胞含量，而血浆与脾脏之间Thl7细胞含量无明显差异，说明不同组织Thl7细胞分布不完全一致，并且血浆Thl7细胞跟气道内中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关，Thl7细胞与气道内中性粒细胞的相关性高于与嗜酸性粒细胞的相关性，Thl7细胞可能是在胸腺组织中分化成熟后，通过胸腺释放到外周血及其它组织中，促进中性粒细胞及嗜酸性粒细胞在气道内聚集，从而对哮喘气道炎症产生影响，本研究证明CD4+IL．17A+11117细胞亚群在哮喘发病过程中发挥了重要作用，从而弥补111l厂rh2介导的效应机制的不足。但是OVA抗原诱导的哮喘所致的Thl7细胞表达增加的情况在人类哮喘是否也存在?此问题尚不明确。已经有研究表明【18】，与Thl7细胞的促炎功能不同，FOXP3+(forkheadboxP3+)的Treg细胞具有抗炎性，可以抑St]OVA诱导的过敏性炎症的扩散，其在控Sf]IL一4介导的病理模式，特别是在慢性过敏性炎症中发挥着重要的调节作用。Thl7细胞与FOXP3+的诱导型Treg细胞(inducedregulatoryTcells，iTreg)存在相互制约的关系【ll，19乏¨，且Thl7和iTreg产生于同一前体细胞，受到多种相同细胞因子的调控，所以需要进一步证实的问题是在哮喘机体的微环境中是否同时存在类似Thl厂rll2平衡的新的Thl7／iTreg平衡【22‘251。总之，本研究明确了Thl7细胞在哮喘小鼠中表达增加，为进一步研究Thl7与FOXP3+Treg细胞亚群在哮喘过敏性炎症中的动态平衡提供了基础。参考文献【1】1BarnesPJ．Immunologyofasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease．NatRevImmun01．2008；8(3)：183—92．【2】OuyangRY，HuCP，ChenP，ZhuJQ，HuangXG．EffectofThl／Th2cytokine27 第二部分11117细胞在哮喘发病中作用机制的研究inlnluneimbalanceontheexpressionofnervegrowthfactorsinasthma．ZhongNanDaXueBaoYiXueBan．2007Feb；32(1)：l19．23．Chinese．[3】BarnesPJ．Immunologyofasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease．NatRevImmun01．2008；8(3)：183—92．【4】倪慧萍，胡国成，顾燕明，石筱蕾．支气管哮喘患儿哮喘严重程度与血清过敏原特异性IgE关系的研究．福建医药杂志．2007；29(3)：37．39．[5】TavakkolAfshariJ，FaridHosseiniRHosseiniFarahabadiS，HeydarianF，BoskabadyMH，KhoshnavazRRazaviA，GhayoorKarimianiE，GhasemiG．AssociationoftheexpressionofIL一4andIL一13genes，IL一4andIgEserunllevels晰tIlallergicasthma．IranJAllergyAsthmaIrnmun01．2007Jun；6(2)：67-72．【6】MovahediM，MoinM，GharagozlouM，AghamohammadiA，DianatS，MoradiB，NicknamMH，NikbinB，AmirzargarA．AssocimionofHLAclassIIalleleswithchildhoodasthmaandTotalIgElevels．IranJAllergyAsthmaImmun01．2008Dec；7(4)：215-20．【7】7HarringtonLE，HattonRD，ManganPR,eta1．Interleukin17一producingCD4+effectorTcellsdevelopviaaliesgedistinctfromtheThelpertype1andlineages．NatImmunol，2005，6(11)：1123【8】ParkH，LiZX，YangXO，eta1．AdistinctlieageofCD4+Tcellsregulatestissueinflammationbyproducinginterleukin17．NatImmunol，2005，6(11)：1133【9】WeaverCT，HarringtonLE，ManganPR,eta1．Thl7：AneffectorCD4+Tcelllineage嘶tllregulatoryTcellTies．Immunity，2006，24(4)：677[10】WilsonNJ，BonifaceK，ChanJR,eta1．Development，cytokineprofileandfunctionofhumanintefleukin17-producinghelperTcells．NatImmunol，2007，8(9)：950[11】BettelliE，CartierY，GaoW，eta1．ReciprocaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTH17andregulatoryTcells．Nature，2006，441(7090)：235[12】HarringtonLE，HattonRD，ManganPR,eta1．Interleukin17．producingCD4+ 硕士学位论文effectorTcellsdevelopviaalineagedistinctfromtheThelpertypeland2lineages．NatImmunol，2005，6(11)：l123【13】DuanW，ChanJH，WongCH，eta1．Anti·inflammatoryeffectsofmitogen·activatedproteinkinaseinhibitorU0126inanasthmamousemodel．JImmunol，2004，172(11)：7053[14】HumblesAA，LuB，NilssonCA，eta1．ArolefortheC3aanaphy7latoxinreceptorintheeffectorphaseofasthma．Nature，2000，406(6799)：998【15】EssakalliM，BrickC，BennaniN，BenseffajN，OuadghiriS，AtoufO．ThelatestTH17lymphocyteinthefamilyofTCD4+lymphocytes．PatholBiol(Paris)．2009Mar17．[Epubaheadofprint】．[16】KongQF，SunB，BaiSS，ZhaiDX,WangGY，LiuYM，ZhangSJ，Li咫ZhaoW，SunYY，LiN，WangQ，PengHS，JinLH，LiHL．AdministrationofbonemarrowstromalcellsamelioratesexpefimentalautoimmunemyastheniagravisbyalteringthebalanceofThl／Th2／Thl7／TregcellsubsetsthroughthesecretionofTGF—beta．JNeuroimmun01．2009Feb15；207(1-2)：83—91．【17】HomeyB．AfterTHl／TH2nowcomesTreg／THl7：significanceofThelpercellsinilTlnluneresponseorganization．Hautarzt．2006Aug；57(8)：730—2．【18】CurottodeLafailleMA，KutchukhidzeN，ShenS，eta1．AdaptiveFoxp3+regulatoryTcell—dependentand—independentcontrolofallergicinflammation．Immunity,2008，29(1)：114【19】ZhouL，LopesJE，ChongMM，eta1．TGF—p-inducedFoxp3inhibitsTHl7celldifferentiationbyantagonizingRORrtfunction．Nature，2008，453(7192)：236【20】BettelliE，CartierY，GaoW，eta1．ReciprocaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTHl7andregulatoryTcells．Nature，2006，441(7090)：235【21】HoPP，SteinmanL．Thearylhydrocarbonreceptor：aregulatorofThl7andTregcelldevelopmentindisease．CellRes，2008，18(6)：605【22】FavreD，LedererS，KanwarB，MaZM，ProllS，KasakowZ，MoldJ，SwainsonL，BarbourJD，BaskinCRPalermo如PandreaI，MillerCJ，KatzeMG，McCuneJM．CriticallossofthebalancebetweenThl7andTregulatorycell 第二部分Tlll7细胞在哮喘发病中作用机制的研究populationsinpathogenicSIVinfection．PLoSPathog．2009Feb；5(2)：e1000295．【23】NistalaKWedderburnLR．Thl7andregulatoryTcells：rebalancingpro—andanti-inflammatoryforcesinautoimmunearthritis．Rheumatology(Oxford)．2009Mar5．【Epubaheadofprint]．[24】BoissierMC，AssierE，FalgaroneG，BessisN．ShiftingtheimbalancefromThl／Th2toThl7／treg：thechangingrheumatoidarthritisparadigm．JointBoneSpine．2008Jul；75(4)：373-5．Epub2008Jun24．【25】EisensteinEM，WilliamsCB．Title：TheTreg／Thl7CellBalance：ANewParadigmforAutoimmunity．PediatrRes．2009Feb11．[Epubaheadofprint]．30 硕士学位论文第三部分白介素一17A在哮喘小鼠中的表达及意义支气管哮喘是多种炎性细胞和炎症因子相互作用而形成的慢性呼吸道炎症性疾病。最近研究发现【H】，IL．17A是由一种新型的不同于l型和2型的CD4+效应T细胞一Thl7细胞亚群特异性产生。IL．17A由含有一个N．末端信号肽的155个氨基酸组成并由二硫键连接的同型二聚体糖蛋白。IL—l7A能激活一些细胞包括肺上皮细胞在内的丝裂素活化的蛋白激酶(MAPK)通路相关的3个成员，细胞外信号调节激酶(ERKl／2)、Jun蛋白N．端激酶(JNK)及P38[5-6]。在下游的信号转导通路中，可以迸一步激活依赖于TNF受体相关因子．6的核转录因子NF—r．B，从而产生多种细胞因子及趋化因子，在机体内引起一系列的炎症反应【7】。它的作用靶点为气道上皮细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞，作为一种前炎症因子，IL．17A可以诱导气道上皮细胞及成纤维细胞增加表达多种细胞因子，如IL．6，IL．8，G．CSF，GM．CSF及粒细胞趋化蛋白．2[8-91，共同催化多种细胞在气道内浸润，这些炎症细胞相互作用又可以分泌多种细胞因子，构成炎症细胞及炎症因子之间的复杂网络，从而形成气道的慢性炎症。IL．17A是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因素，可以通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子，对炎症细胞有强大的化学趋化作用，从而增加气道内炎症细胞募集、活化。但是对于IL．17A是否参与哮喘过敏性气道炎症及在哮喘状态下不同组织中的表达情况目前研究尚未明确。我们拟通过动物哮喘模型观察IL．17A在小鼠体内的表达情况及其对哮喘气道炎症的影响，初步探讨IL．17A在哮喘发病机制中的作用。1材料与方法1．1主要试剂及材料：卵蛋白(OVA)：美[]Sigma公司；氢氧化铝：天津福晨化学试剂厂；MouseIL．17AELISAkit：达科为公司；粤华牌WH．2000型超声波雾化器：广东粤华医疗器械厂有限公司；酶标仪：美l雪Sigma公司。3l 第三部分白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义1．2实验动物及分组：SPF级雌性BALB／cdx鼠(南方医科大学实验动物中心)28只，4-6周龄，体重18"～209，随机分为2组，每组14只；A组为正常对照组，B组为哮喘模型组。1．3模型的制备：根据国内外学者制作的优化方案【lo．111，B组小鼠于实验流程的第0天和第14天给予腹腔注射生理盐水混悬液(含OVA2mg，氢氧化铝乳化液5mg)2009l致敏，第21d开始先给予I％OVA生理盐水2009l滴鼻激发，随后给予2％OVA生理盐水雾化液40ml经超声雾化器雾化吸入，每天1次，每次持续约40min，连续6d。A组以生理盐水代替致敏液、滴鼻液及雾化液，方法同B组。1．4BALF的收集及制备：在最后一次激发后1h，小鼠摘眼球放血后颈椎脱臼处死，两组小鼠各随机选取6只行支气管肺泡灌洗术。将回收的BALF涂片，固定，HE染色，光学显微镜下进行细胞总数和细胞分类计数，细胞分类至少计数400个细胞，求出各分类计数细胞所占百分比。1．5肺组织病理切片：两组小鼠各随机选取6只行开胸取肺组织，置于10％中性甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况。拍片。1．6外周血及肺、脾、胸腺组织悬液ELISA检测：外周血通过摘眼球采取，肝素化处理，肺、脾及胸腺组织用眼科剪剪成小块后，筛网上研磨成匀浆，外周血及肺、脾、胸腺组织悬液分别置于5％的CO。、37。C孵育箱培养24h后，以3000r／min离心lOmin，将上清液保存在一20℃冰箱用作IL-17A的测定。ELISA检测的方法如下：1．使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。2．根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白都做复孔。3．加样：100ul／well加入稀释后的Cytokinestandard至标准品孔，lOOul／well加入样品至样品孔，设置空白孔，用Washing32 硕士学位论文buffer(1X)代替样本和标准品。4．加检测抗体：50ul／well加入稀释后的Biotinylatedantibody。混匀后，盖上封板膜，37。C温育90min。5．洗板：扣去孔内液体，300ul／well加入1Xwashingbuffer；停留lmin后弃去孔内液体。重复4次，最后一次在滤纸上扣干。6．加酶：lOOM／well加入稀释后的Streptavidin—HRP。盖上封板膜，37。C温育30min。7．洗板：扣去孔内液体，300ul／well加入1Xwashingbuffer：停留lmin后弃去孔内液体。重复4次，最后一次在滤纸上扣干。8．显色：lOOul／well加入TMB，37"C避光温育20-30min，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。9．终止反应：lOOul／well迅速加入Stopsolution终止反应。10．读板：终止后10分钟内，用双波长即检测波长(measurementwavelength)450nm、参考波长或校正波长(referencewavelength)630nm在酶标仪上同时读板。1．7统计学处理数据以均数4-标准差(娃s)表示。采用SPSS13．0软件。两组间样本均数进行t检验；多组数据间比较采用One．WayANOVA，方差齐性用LSD方法，方差不齐用Tamhane’SWE方法；相关性检验采用Pearson直线相关性分析。P<0．05表示差别有统计学意义。2结果：2．1BALF中细胞总数和分类比较：@BALF细胞总数：两组间存在显著性差异，B组BALF细胞总数显著高于A组(P<0．01)。(至)BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率：两组间存在显著性差异，B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率显著高于A组(尸<0．01)。(见表4) 第三部分自介素．17A在哮喘小鼠中的表达厦意义表4两组BALF中细胞总数和分类的比较(n《，xis)Tab4COmD"isonoflhetotalcellfzumb盯andclassificationofBALFbetweennormalcontrolgroupandasthmamodelgrouch=6．MeartSD)groupTO叫cellNeu(％)Eel％)M-c(％)Lym(％)(x103／m1)groupA064±0】266扯159117土1188I92±3221029±260groupBl32±020”2908±-438”261Ⅲ05”2804±489I57l±3蚰t·7034-lI8201453222549．3．299·+与A组相比较，<001。2．2小鼠肺组织病理切片(HE染色)：哮喘组支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，肺间质及肺泡腔内町见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，气道上皮损伤，结构紊乱，气道内杯状细胞肥大增生，气道内分泌大量黏液并有粘液栓形成．粘膜下胶原纤维沉积。对照组肺组织气道结构清晰，气道纤毛上皮排列整齐，无明显的炎症改变及胶原纤维沉积。(见图6) 硕士学位论文图6两组肺组织HE染色A为正常对照组HEx200；B为哮喘模型组HEx200；C为正常对照组HEx400：D为哮喘模型组HEx400Fig．6HEstainingoflungtissuefromtwogroupsA：normalcontrolgroupHEx200；B：asthmaticmodelgroupHEx400；C：normalcontrolgroupHEx400；D：asthmaticmodelgroupHEx4002．3IL．17A在小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度：IL．17A在A组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为10．944-5．02(×10pg／m1)，13．634-4．07(x10pg／g)，16．37+9．85(x10pg／g)，22．45+10．89(x10pg／g)，IL．17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的浓度分别为52．234-19．08(x10pg／m1)，52．984-10．81(x10pg／g)，54．77+10．80(×10pg／g)，86．684-10．29(×10pg／g)。IL一17A在B组小鼠血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中的表达水平显著增高，与A组相比差异均有显著性意义(P0．05)。2．4相关性分析：哮喘模型组肺组织中IL．17A的水平与BALF中嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关(间．832，P=-0．040；r=0．856，P=O．030)。(见图7)35 第三部分白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义N鳓(％)，誊。厶一l拍舯一档OO一／B的O参一一S摹∞o一∞ao一鹅．al扣。l}lIl∞·∞娩瑚M舯拍·∞衡∞誓∞3蝴Eos(％)图7哮喘模型组肺组织中IL．17A与BALF中嗜中性粒细胞(A)和嗜酸性粒细胞(B)的曲线估计。Fig．7CorrelationsofIL一17Ainthelungtissuestoneutrophils(A)andeosinophils(B)intheBALFofasthmaticmice．3讨论小鼠哮喘模型能模拟出人类哮喘的诸多特征，特别是在细胞免疫方面两者更具有相似性。我们通过对BALB／c／Jx鼠用OVA致敏和激发后建立哮喘模型，可见气道及血管周围较多嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润，气道上皮结构紊乱，杯状细胞肥大增生，气道内分泌大量黏液并有粘液栓形成，粘膜下胶原纤维沉积等病理改变。实验结果显示：哮喘模型组血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中IL．17A的水平明显高于正常对照组；并且IL．17A在胸腺组织中的表达更高。哮喘小鼠肺组织中IL．17A的含量与BALF中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞呈正相关。关于IL．17A在哮喘发病中的作用是我们关心的问题。已有研究表明【l引，Thl7细胞产生的细胞因子IL一17A、IL．17F、IL．23在过敏性炎症中都起重要作用。在臭氧诱导产生的小鼠AHR模型中，同样需要IL．17A的存在，野生型小鼠给予抗IL．17的单克隆抗体后不能出现ArtR的反应【13】。众所周知，AHR是哮喘发生发展的一个重要因素。IL．17A是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因素，对炎症细胞有强大的化学趋化作用，可以显著增加呼吸道内炎症细胞募集、活化【12．141。IL-17A还激活上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞释放GM．CSF、TNF．仅、PGE2、 硕士学位论文IL．1、IL．6、IL．8等，这些细胞因子不仅促进气道炎症的进一步加剧，还参与了气道的重构‘8母·15‘161。而呼吸道炎症和呼吸道重构是哮喘的两个主要病理特征。在我们的实验中证明IL．17A参与哮喘气道炎症及气道重建的情况与前面的研究相一致。IL．17A通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症，本实验表明：哮喘发病中IL-17A在不同组织中的分布不完全一致，血浆与肺组织、脾组织之间IL-17A的分布无统计学差异，而胸腺组织IL-17A水平显著高于血清、肺组织、脾组织IL一17A水平，并且我们实验证明哮喘小鼠肺组织中IL．17A的含量与BALF中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞呈正相关，与气道内嗜酸性粒细胞的相关性较高，提示IL．17A可能通过促进嗜酸性粒细胞和中性粒细胞在气道内聚集，参与哮喘气道炎症的发生，特别是在哮喘急性发作中起重要作用。既往观点认为，Th2占优势的Thl／Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制，表现为Thl功能相对抑制，Th2功能相对亢进，进而导致IgE合成增加和嗜酸性粒细胞激活【17_191。但是，这个失衡理论太过简单化，并不能完全解释哮喘全部的病理生理过程。在哮喘急性发作过程中，IL一17A的表达水平增高，提示作为特异性产生IL．17A的Thl7细胞也可能在哮喘发病机制中发挥作用，从而可以弥补Thlm也失衡这个机制的不足。哮喘是一个复杂的免疫性疾病，众多的细胞因子和炎症介质参与发病过程。迄今为止我们所知的1L．17A功能提示，这些分子能引发深刻的生物学应答，可能是哮喘急性发作的始动细胞因子，并在哮喘免疫微调中起重要作用。最近国外研究表明【201，普伐他汀能够减轻过敏性的气道炎症，其中一个机制就是跟普伐他汀抑带iJIL．17A的产生有关。提示可以通过抑制或者调节这些蛋白质的功能，从炎症反应的上游进行阻断，达到控制哮喘的发作，从而对哮喘起治疗性的应用。 第三部分白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义参考文献[2】HarringtonLE，HattonRD，ManganPR,eta1．Interleukin17-producingCD4+effectorTcellsdevelopviaaliesgedistinctfromtheThelpertype1andlineages．NatImmunol，2005，6(11)：1123ParkH，LiZX，YangXO，eta1．AdistinctlieageofCD4+Tcellsregulatestissueinflammationbyproducinginterleukin17．NatIrm'nunol，2005，6(11)：1133WeaverCT，HarringtonLE，ManganP1Leta1．Thl7：AneffectorCD4+TcelllineagewithregulatoryTcellTies．Immunity，2006，24(4)：677WilsonNJ，BonifaceK，ChanJR,eta1．Development，cytokineprofileandfunctionofhumaninterleukin17一producinghelperTcells．NatImmunol，2007，8(9)：950RahmanMS，YamasakiA，YangJ，eta1．IL·17Ainduceseotaxin—I／CCchemokineligand1expressioninhumanairwaysmoothmusclecells：roleofMAPK(Erkl／2，JNK，andp38)pathways．Jlmmunol，2006，177：4064·71．PatelDN，KingCA，BaileySR，eta1．Interleukin-17stimulatesC—reactiveproteinexpressioninhepatocytesandsmoothmusclecellsviap38MAPKandERKl／2一dependentNF—kappaBandC／EBPbetaactivation．JBiolChem．2007．282：27229．38．[7】KaoCY，HuangF，ChenY，eta1．Up—regulationofCCchemokineligand20expressioninhumanairwayepitheliumbyIL一17throughaJAK-independent[8】【9】butMEK／NF-kappaB-dependentsignalingpathway．JImmunol，2005，175：6676—85．PrauseO，LaanM，L6tvallJ，eta1．Pharmacologicalmodulationofinterleukin．17．inducedGCP．2。GRO．alphaandintefleukin-8releaseinhumanbronchialepithelialcells[J]．EurJPharmac01．2003，462(1-3)：193—8．JonesCE，ChanK．Interleukin一17stimulatestheexpressionofinterleukin一8，growth—relatedoncogene-alpha，andgranulocyte—colony—stimulatingfactorbyhumanairwayepithelialcells[J]．AmJRespirCellMolBiol，2002，26(6)：381JpHp№ 硕士学位论文748-53．[10】DuanW，ChanJH，WongCH，eta1．Anti—inflammatoryeffectsofmitogen—activatedproteinkinaseinhibitorU0126inanasthmamousemodel[J]．JIrnmun01．2004，172(11)：7053—9．【11】HumblesAA，LuB，NilssonCA，eta1．ArolefortheC3aanaphylatoxinreceptorintheeffectorphaseofasthrna[J]．Nature，2000，406(6799)：998—1001．[12】CheungPF，WongCK，LamCW．MolecularmechanismsofcytokineandchemokinereleasefromeosinophilsactivatedbyIL一17A，IL一17F，andIL一23：implicationforThl7lymphocytes—mediatedallergicinflammation[J]．JImmunol，2008，180(8)：5625-35．[13】PichavantM，GoyaS，MeyerEH，eta1．OzoneexposureinamousemodelinducesairwayhyperreactivitythatrequiresthepresenceofnaturalkillerTcellsandIL-17[J]．JExpMed，2008，205(2)：385-93．【14】LiangSC，LongAJ，BennettF，eta1．AnIL-17F／Aheterodimerproteinisproducedbymouse11117cellsandinducesairwayneutrophilrecruitment[J]．JImmun01．2007，179(11)：7791-9．【15】LindenA，LaanM，AndersonGP．Neutrophils，interleukin-17Aandlungdisease[J]．EurRespirJ，2005，25(1)：159-172．[16】HuangF，KaoCY，WachiS，eta1．RequirementforbomJAK—mediatedP13KsignalingandACTl／TRAF6／TAKl--dependentNF--kappaBactivationbyIL·-17Ainenhancingcytokineexpressioninhumanairwayepithelialcells[J]．JImmunol，2007，179(1O)：6504—13．[17】BarnesPJ．Immunologyofasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease．NatRevImmun01．2008；8(3)：183-92．f18】OuyangRY,HuCP，ChenP，ZhuJQ，HuangXG．EffectofThl／Th2cytokineilllllluneimbalanceontheexpressionofnervegrowthfactorsinasthma．ZhongNanDaXueBaoYiXueBan．2007Feb；32(1)：l19-23．Chinese．【19】LiLQ，HuoLL，ZhangXG，YuJE．ProgressinresearchonrelationshipbetweenbronchialasthmaandThl／Th2imbalance．ZhongXiYiJieHeXueBao．2005Sep；3(5)：403—7．Review．Chinese．39 第三部分白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义【20】lmamuraM，OkunishiK，OhtsuH，eta1．Pravastatinattenuatesallergicairwayinflammationbysuppressingantigen--sensitization,IL·-17production,andantigen·presentationinthelung[J]．Thorax，2008，[Epubaheadofprint]． 硕士学位论文全文小结本研究首先使用OVA致敏及滴鼻联合雾化激发的方法建立了BALB／c小鼠哮喘模型，通过流式细胞术检澳1]Thl7细胞内的IL一17A，IL一17A是一种分泌型的胞内蛋白，由Thl7细胞特异性产生，检测此蛋白需使用莫能菌素阻断高尔基体分泌，并由皂素作为打孔液穿破细胞膜，使荧光标记的的抗体与胞内的IL一17A结合，其次运用双抗体夹一I=．,ELISA的方法检Nrhl7细胞分泌的游离型1L一17A，探讨1L一17A在哮喘小鼠多种组织中的表达及意义，初步探索Thl7细胞在哮喘小鼠发病中的作用机制，现对全文取得的研究成果总结如下：1．BALB／c／J',鼠经OVA和乳化的氢氧化铝腹腔注射致敏后，采用滴鼻联合雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型，其病理变化更加符合哮喘气道的病理生理改变。2．与正常小鼠相比，哮喘小鼠外周血、脾脏和胸腺中Thl7细胞的表达明显增加，哮喘的胸腺组织中Thl7细胞含量显著高于血浆、脾脏及肺组织中Thl7细胞含量，而血浆与脾脏之间Thl7细胞含量无明显差异，说明不同组织Thl7细胞分布不完全一致，并且血浆Thl7细胞跟气道内中性粒细胞及嗜酸性粒细胞呈正相关，说明Thl7细胞也参与了哮喘的发病机制，在哮喘中的作用可能是在胸腺组织分化成熟后，通过胸腺释放入外周血及其它组织中，从而参与哮喘气道炎症的发生，对哮喘发病机制进行了很好的补充和完善。3．Thl7细胞特异性产生的IL-17A在哮喘组血清及肺、脾、胸腺组织匀浆中IL-17A的水平明显高于对照组，哮喘发病中IL一17A在不同组织中的分布不完全一致，血浆与肺组织、脾组织之间IL一17A的分布无统计学差异，而胸腺组织IL一17A水平显著高于血清、肺组织、脾组织IL一17A水平，并且我们实验证明哮喘小鼠肺组织中IL一17A的含量与BALF中性粒细胞和嗜酸性粒细胞呈正相关，与气道内嗜酸性粒细胞的相关性较高，提示IL一17A可能通过促进嗜酸性粒细胞和中性粒细胞在气道内聚集，参与哮喘气道炎症的发生，特别是在哮喘急性发作中起重要作用。41 攻读学位期间成果龚雨新，于化鹏，邓火金等．Thl7细胞在哮喘小鼠发病中的作用机制研究．解放军医学杂志．2009；34(1)：72．75．龚雨新，于化鹏，陈新等．白介素．17A在哮喘小鼠中的表达及意义．南方医科大学学报．2009；29(2)：256．8．龚雨新，于化鹏．白介素．17A在哮喘发病机制中的研究进展．中国呼吸与危重监护杂志．2009；8(2)：199．201． 硕士学位论文·综述·白介素17A在哮喘发病机制中的研究进展龚雨新于化鹏南方医科大学珠江医院呼吸科(广东广州510282)Researchprogressofinterleukin-17AinthePathogenesisofAsthmaGONGYu-xin,YUHua-peng摘要：白细胞介素(IL)．17A是最近发现的一种细胞因子，是属于一个独特类型的具有多种功能的细胞因子，可以通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症，在炎症性疾病和自身免疫性疾病，特别是在哮喘过敏性气道炎症、气道高反应性及气道重构中发挥重要作用。本文将对其结构、功能、参与的信号通路及其在哮喘发病中的作用机制进行综述。关键词：IL．17AThl7哮喘发病机制【Abstract]Interleukin(IL)-17Aisacytokinethatdiscoveredrecently，belongstoauniquetypeofmulti—functionalcytokines，whichcoordinatesthelocalinflammationoftissuesbyinducingthereleaseofproinflammatoryfactorsandmobilizingneutrophils，SOitplaysallimportantroleininflammatorydiseasesandautoimrnunediseases，especiallyinallergicairwayinflammation，airwayhyperresponsivenessandairwayremodelinginasthma．Inthisreviewwediscussthestructuresandfunctionsandparticipatedsignalpathwaysaswellastherolesinthepathogenesisofasthma．[Keywords]IL一17A；Thl7；asthma；pathogenesis哮喘的发病机制十分复杂，Th2占优势的Thl／Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制，表现为Thl功能相对抑制，Th2功能相对亢进，进而导致IgE合成增加及Th2型细胞因子的产生，这些细胞因子在哮喘发病中发挥重要作用。但是，这个理论并不能完全解释哮喘全部的病理生理过程。而Thl7细胞和Thl7细胞43 综述特异性产生的IL．17A对哮喘发病机制进行了补充和完善。一、IL．17A的结构及家族成员通常，IL．17是指IL．17A。IL．17的eDNA是从小鼠杂交瘤的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA．8)中分离并被克隆，与CTLA．8有83％的同源性，同时与单纯疱疹病毒的开放阅读框架基因13(HVSl3)编码的蛋白有58％的同源性【l】，IL．17A的基因编码位点存在于人类6号染色体和小鼠l号染色体中，与IL．17F基因相隔46050个碱基对，在IL．17斛基因座内存在调控区域控制它们的表达。人IL．17A的基因产物是一种由155个氨基酸组成的、由二硫键连接的30～35kDa的同型二聚体糖蛋白。重组IL．17A在还原条件下的分子量是15kD，也提示IL．17A是以同源二聚体的方式分泌。通过对人类和其他脊柱动物基因组的大规模测序发现某些基因编码的蛋白与IL．17A密切相关，因此命名了一组新的细胞因子家族，即IL．17家族，IL．17A是这个家族的最初成员。除了IL．17A，还包括IL．17B、IL．17C、IL．17D、IL．17E(即IL．25)及IL．17F(即ML．1)。到目前为止，在人类及小鼠中至少存在6个IL．17家族成员，另外5个家族成员与IL．17A有20％,--50％的同源性。IL．17家族成员具有高度保守的半胱氨酸序列，其中涉及的分子内及分子间的二硫键的结构是这个家族共同的结构和功能特征。IL．17家族成员及受体的分子结构与其他已知的细胞因子家族没有明显的相似性，因此，它们可能代表了脊柱动物进化过程中一种高度保守的不同的信号传递系统，并可能在气道炎症性疾病中发挥重要作用。二、IL．17A受体及相关信号转导IL．17A的受体(IL．17R)最初通过IL一17的一种病毒同源体作为配体在小鼠体内发现，这种配体能够结合人及小鼠的IL．17A[21。相较于其他已知的细胞因子受体家族，IL．17R是一种非常独特的I型膜受体，其缺乏常见于其他细胞因子受体中的保守信号区域。IL．17R的基因表达在人的几种细胞类型上，例如肺上皮细胞、成纤维细胞、B细胞、粒细胞及胚胎肾细胞。人的IL．17R与鼠相比存在69％的序列同源性，并且对IL．17R转染的细胞与标记的人IL．17A直接结 硕士学位论文合测定揭示了它们之间相对低亲和力结合，二者结合的恒定值在107．108M之间。由于较低浓度(毫微克范围)的IL．17A就足以发挥其生物学活性，因此这种低亲和力的结合表明IL．17A与受体之间存在着一个额外的结合亚单位来形成一个高亲和力的复合体，但这个亚单位的确定及存在位置仍然需要进一步研究。IL．17A能激活一些细胞包括肺上皮细胞在内的丝裂素活化的蛋白激酶(MAPK)通路相关的3个成员，细胞外信号调节激酶(ERKl／2)、Jun蛋白N．端激酶(JNK)及P38t3一¨。IL．17A诱导激活P38MAPK信号通路，能上调一氧化氮诱导合成酶(iNOS)及环氧合酶．2(COX．2)基因表达【5】。在软骨细胞中，iNOS和NO的上调能引起软骨基质降解，有赖于酪氨酸激酶的级联放大效应，这种作用是蛋白激酶C(PKC)依赖性的。IL．17A还可以通过激活依赖P38MAPK转录后的信号通路，增强TNF．0【诱导的气道平滑肌细胞分泌具有中性粒细胞趋化作用的细胞因子IL．8【61。除了能够激活MAPK通路外，IL．17A还能够触发Janus激酶(JAK)信号转导途径中的某些成员发生酪氨酸磷酸化，在下游的信号转导通路中，可以进一步激活依赖于TNF受体相关因子．6的核转录因子NFrJ3，从而产生多种细胞因子及趋化因子，在机体内引起一系列的炎症反应r71。三、IL。17A与Thl7的关系早期认为，人外周血单个核细胞在体外某种特定的条件下，CD4+记忆性T淋巴细胞可以表达IL．17A的mRNA。后来在小鼠体内的的研究表明【8-91，CD8+的记忆性T淋巴细胞刺激后也可以产生IL．17A，更具体地说应该是CD45RO十T淋巴细胞，这个观点在人体内也得到证实。Ferretti等19]使用缺乏T淋巴细胞的SCID小鼠来检测IL．17A的表达情况，发现与正常小鼠相比，SCID小鼠中IL．17A的产生减少90％以上。Happel等【8】学者用单克隆抗体清除CD4+和CD8+T淋巴细胞后，也得到相似的结果。这些研究都间接支持T淋巴细胞作为IL．17A的一个主要来源。近来研究发现【lo．121，机体存在一种新型的不同于l型和2型的CD4+效应T细胞～Thl7细胞亚群，该细胞是由天然T细胞前体Th0细胞分化而来，具有与Thl、Th2细胞不同的独立的分化和发育调节机制，其在促炎症反应和自身免疫45 综述性疾病中发挥重要作用。由于该细胞亚群能够特异性地产生IL．17A效应因子，因此被命名为Thl7细胞。除了能够产生IL．17A外，还能够产生IL．17F、IL．22、GM．CSF、IL．6、TNF．0【等细胞因子，而不产生IFN-T和IL．4。由于具有促炎性作用，也称为炎症性T细胞。Thl7细胞特异性分泌的IL．17A的作用靶点为气道上皮细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞，能诱导产生不同的细胞因子及调节因子【131。最近有文献报道【141，Thl7细胞的产生是一些自身免疫性疾病的主要发病因素，研究人员发现在EAE小鼠中枢神经系统中存在大量分泌IL．17A的CD4+T淋巴细胞。四、IL．17A在哮喘发病机制中的作用IL．17A是属于一种独特类型的具有多种功能的细胞因子，可以通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症，在炎症和自身免疫性疾病，特别是在哮喘过敏性气道炎症、气道高反应性(AHR)及气道重构中发挥的重要性引起了广泛关注。1．IL．17A与哮喘气道炎症的关系中性粒细胞可以使急性哮喘恶化及哮喘急性发作的症状加重，慢性重症哮喘患者(相当于重度持续的哮喘患者)的气道中也存在大量的中性粒细胞；夜间哮喘发作与中性粒细胞有关，少数死于哮喘突发事件的患者中，其痰液中主要为中性粒细胞而不是嗜酸性粒细胞。这说明中性粒细胞在哮喘气道炎症中起了很重要的作用。使用抗CD4抗体和抗IL．2受体的抗体均能够抑制变应原诱导的中性粒细胞在气道内募集，说明中性粒细胞在气道内的募集受某种T淋巴细胞所控制。研究还发现【15-161，活化的T淋巴细胞可以产生IL．17A，认为CD4+T淋巴细胞诱导中性粒细胞在气道内的募集可能是通过IL．17A起作用的。经酒精处理的小鼠模型在细菌刺激时，气道内中性粒细胞数目较对照组明显减少，且与支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL．17A水平呈正相关。而如果在气道内注入外源性的IL．17A，则中性粒细胞对炎症的反应可恢复正常水平，说明IL．17A与中性粒细胞在气道内的募集密切相关。在哮喘大鼠肺组织中【17】，Thl7细胞分泌的IL．17A与BALF中的嗜酸性粒 硕士学位论文细胞及中性粒增多有显著正相关性，因此，IL．17A可能与哮喘中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞增多有关，但这是一种因果关系还是一种平行的非因果关系，目前尚难以确定，还需要更多的实验证实。国外有文献报道【18】，通过对哮喘病人痰液中IL．17mRNA及IL．8mRNA的检测，发现哮喘组较健康对照组显著增加，并与痰液中中性粒细胞相关，在中重度持续哮喘病人经吸入糖皮质激素治疗后，IL．17mRNA仍处于高水平。最近国内也有不少学者报道[19。20l，在气道炎症性疾病中，包括哮喘及COPD，IL．17A都扮演了重要的角色。2．IL．17A与AHR的关系众所周知，AHR是哮喘发生发展的一个重要因素。NakaeS．等学者【21J在IL．17基因缺陷的小鼠内发现抗原特异性的T细胞致敏作用受损，AHR的反应能力下降，IL．4、IL．5及抗原特异性的IgE产生减少，导致过敏性的细胞反应和体液反应均受到抑制。同样在IL．17R基因敲除的小鼠中也得到证实f22】，IL．17R基因敲除的小鼠其肺泡及气道内募集中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的能力下降，肺组织嗜酸性粒细胞过氧化物酶激活，以及卵清白蛋白(OVA)特异性的IgE产生减少，与野生型小鼠相比，IL．17R基因敲除的小鼠气道不能对各种免疫、物理和化学刺激因子呈现高反应性。最近的研究证实【23】：在臭氧诱导产生的小鼠AHR模型中，同样需要IL．17A的存在，野生型小鼠给予抗IL．17A的单克隆抗体后不能出现AHR的反应。3．IL．17A与气道重构的关系跟健康对照相比，哮喘患者痰液及BALF中IL．17A的含量显著增加【24J。为了进一步探讨IL．17A在哮喘患者体内的作用机制，作者观察了IL．17A对哮喘病人及非哮喘病人支气管活检组织中成纤维细胞的影响，发现IL．17A确实能增强成纤维细胞产生促纤维化因子IL．6和IL．1l，还可以增加其他成纤维细胞源性的炎症介质的产生，如a．催化因子，IL．8及生长相关的癌基因．a(GRO．0【)。这些细胞因子具有促进T细胞增生、使幼稚CD4+T细胞演化为产生IL．4的细胞，增加胶原蛋白在气道内沉积，抑制细胞外基质分解，促进纤维化等作用，从而引起哮喘气道的重构。除了激活成纤维细胞外，IL．17A还激活上皮细胞、巨噬细胞释47 综述放GM．CSF、TNF．a、PGE．2、IL．1、IL．6、IL．8【25。271，这些细胞因子除了能够增加胶原蛋白聚集、抑制细胞外基质的分解外，还可以刺激纤维结缔组织形成及气道平滑肌的增生，因此，IL一17A可能也通过这些途径参与了哮喘的炎症反应和气道重塑。但也不能排除IL．17A对中性粒细胞及气道病变具有直接作用，有关这方面的研究，亟待深入进行。五、结语支气管哮喘是一种以气道高反应性和慢性炎症为主要特征并反复发作的变态反应性疾病。其发病机制尚未完全明了。较统一的观点认为哮喘是多种细胞如上皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞参与的慢性气道炎症。支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌物充满气道造成气道慢性炎症，是哮喘患者急性发作的一个重要环节。在哮喘炎症中T淋巴细胞发挥着重要的免疫调节作用，Th2占优势的Thl／Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制，Th2细胞分泌细胞因子IL．4、IL．13、IL一5和IL．9，其中IL．4和IL．13促使B细胞生产IgE，IL．5负责骨髓嗜酸性粒细胞的分化，IL．9能吸引肥大细胞并引起肥大细胞的分化【281。IL．17A是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因素，对炎症细胞有强大的化学趋化作用，可以显著增加气道内炎症细胞募集、活化，从而诱导和加重哮喘的急性发作。气道炎症是哮喘最重要的发病机制，而AHR和气道重构也是哮喘的二个重要病理生理特征。在哮喘发病过程中，IL．17A的表达水平增高，并且在哮喘过敏性气道炎症、AHR及气道重构中都有重要作用，提示作为特异性产生IL．17A的Thl7细胞也可能在哮喘发病机制中发挥作用，从而可以弥补nllm亿失衡这个机制的不足。哮喘是一个复杂的免疫性疾病，众多的细胞因子和炎症介质参与其发病过程。迄今为止我们所知的1L．17A的功能提示，这些分子能引发深刻的生物学应答，并可能在哮喘免疫微调中起重要作用。最近国外研究表明例，普伐他汀能够减轻过敏性的气道炎症，其中一个机制就是跟普伐他汀抑伟EJIL．17A的产生有关。提示可以通过抑制或者调节这些蛋白质的功能，从炎症反应的上游进行阻 硕士学位论文断，达到控制哮喘的发作，可能对哮喘起治疗性的应用。参考文献【1】KatohS,KitazawaH，ShimosatoT，eta1．CloningandcharacterizationofSwineinterleukin-17，preferentiallyexpressedintheintestines．JInterferonCytokineRes，2004，24：553—9．[2】LiTS，LiXN，ChangZJ，eta1．Identificationandfunctionalcharacterizationofanovelinterleukin17receptor：apossiblemitogenicactivationthroughras／mitogen-activatedproteinkinasesignalingpathway．CellSignal，2006，18：1287-98．[3]RahmanMS，YamasakiA，YangJ，eta1．IL-17Ainduceseotaxin-1／CCchemokineligand1expressioninhumanairwaysmoothmusclecells：roleofMAPK0三rkl／2，JNK，andp38)pathways．JImmunol，2006，177：4064-71．【4]PatelDN，KingCA，BaileySR,eta1．Interleukin-17stimulatesC—reactiveproteinexpressioninhepatocytesandsmoothmusclecellsviap38MAPKandERKl／2一dependentNF-kappaBandC／EBPbetaactivation．3BiolChem，2007，282：27229—38．[5】MiljkovicDJ，CvetkovicI,VuckovieO，eta1．Theroleofinterleukin一17ininduciblenitricoxidesynthase—mediatednitricoxideproductioninendothelialcells．CellMolLifeSci，2003，60：518-25．[6】HennessS,vanThoorE，GeQ，eta1．IL一17,4,actsviap38MAPKtoincreasestabilityofTNF—alpha-inducedIL一8rnRNAinhumanASM．AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2006，290：L1283-90．【7】KaoCY，HuangF，ChenY，eta1．Up-regulationofCCchemokineligand20expressioninhumanairwayepitheliumbyIL·-17throughaJAK-·independentbutMEK／NF—kappaB-dependentsignalingpathway．JImmunol，2005，175：6676—85．[8】HappelKI，ZhengM，YoungE，eta1．Cuttingedge：rolesofToll—likereceptor4andIL一23inIL一17expressioninresponsetoKlebsiellapneumoniaeinfection．JImmunol，2003，170：4432-6．49 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致谢万分感谢我的恩师于化鹏教授!感谢您为我提供继续学习的机会，能成为您的学生，是我的幸运；三年来，无论是在学习、工作，还是生活上，您都给了我无微不至的关怀和教诲，让我终身受益；正是在您的悉心指导和大力支持，本课题才得以顺利完成；您那高尚的人格、渊博的知识、严谨的治学态度、忘我的敬业精神永远是我努力学习的楷模。一日为师，终生为父，师恩难忘，师情永存!衷心感谢我的论文评阅人，给予我大量的宝贵意见。衷心感谢各位评委在百忙中抽出宝贵的时间评阅我的论文，并参加我的毕业论文答辩，赐予教诲。衷心感谢呼吸科杨振峰主任医师、邓火金副教授、陈新副教授、樊慧珍主治医生、孙丽萍主治医生、王丽珍主治医生、王梅护士长及呼吸科全体护士在临床工作中给予的大力支持和帮助。你们在工作上精益求精的踏实作风，生活上谦虚待人的优秀品格，学术上的求知精神将是我终生学习的榜样。衷心感谢移植免疫实验室孙尔维所长、罗宇维技师，感谢他们在实验中对我的指导和无私帮助。感谢珠江医院生化实验室刘兰平主任、病理科余力主任、肖莎副主任技师给我的指导和帮助。衷心感谢我的同学莫建福、李章球、邓玉光、陈协生、刘俊芳、刘璇，师妹刘书娟、黄琳慧、唐晓媛、易丽对我实验、工作、学习、生活中给予的大力帮助。衷心感谢南方医科大学和南方医科大学附属珠江医院所有关心、 硕士学位论文支持、帮助我的领导和老师们。特别感谢我的父母和我的兄弟姐妹三年来对我的理解、关心和照顾，是你们的默默奉献和全力支持，才使我顺利完成学业，您们的爱是我此生最大的财富。感谢三年来所有曾支持、关心、鼓励和帮助过我的领导、老师、同学、亲人和朋友，在我即将毕业之际，向您们致以最诚挚的谢意。 硕士学位论文统计学核稿证明编号∞g-0301