smo sirna对裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡影响的研究

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1、郑州大学硕士学位论文SmosiRNA对裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡影响的研究姓名：张虎申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：张红；陈奎生201205摘要SmosiRNA对裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡影响的研究硕士研究生：张虎导师：张红教授陈奎生教授郑州大学基础医学院病理学教研室河南省肿瘤病理重点实验室河南郑州450052摘要在消化系统肿瘤中，食管癌是常见恶性肿瘤之一，对人类的健康和生命造成了极大的威胁。其具有发病率高及发病隐匿、转移和死亡率高等特点。目前临床上用于食管癌治疗的方法主要是外科手术治疗、化疗、放疗以及综合治疗，尽管近年来各种治疗方

2、法得以不断改进和完善，但食管癌患者的预后仍然较差，为提高食管癌的疗效和改善患者的生存质量，寻求一种新的治疗方法是当前食管癌治疗的研究热点。Smoothened(Smo)基因是由3772bp构成的DNA序列，基因定位于染色体7q32．3。Smo蛋白是由Smo基因编码的一条具有1024个氨基酸残基组成的蛋白质。Smo蛋白在Hedgehog(m)信号通路中充当着信号转换器的作用，它可以将来自细胞外的Hh信号转换为细胞内可识别的特异性转录因子Glil信号，进而作用于下游靶基因Ptch、Wm、Bmps等。当细胞间质中有Hh配体存在时，Smo蛋白摆脱了Ptch

3、受体的束缚，此时的Smo蛋白将向微管复合体上Fu和Cos2提供磷酸基团促使Glil从复合体上脱离，此时的Gli蛋白转化成催化剂形式并以全长的形式进入细胞核启动下游基因转录。Glil基因定位于染色体12q13．2．q13．3，其与Gli2、Gli3均有5个保守的锌指结构，锌指间由组氨酸与半胱氨酸连接。Glil基因编码的产物Glil蛋白是特异性转录因子，可将胞质内信号传递到细胞核，启动下游基因的转录，Gli基因摘要家族与果蝇Ci基因是同源基因，它们编码的蛋白质在Hh信号通路中起到关键作用。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)指双链RN

4、A(double．strandedRNA，dsRNA)在胞质中Dicer酶(一种核酶)的作用下，以一种ATP依赖的方式逐步将外来的双链RNA(dsRNA)切割成特定长度的小干扰RNA(siRNA)，长度一般为2Int．23nt，siRNA再与体内的内切酶、外切酶和解旋酶等共同组成可被RNA诱导的沉默复合物(RNA—inducedsilencingcomplex，PdSC)，然后RISC激活ATP酶依赖的siRNA解双链过程。外源性、内源性基因编码的mRNA与激活后的RISC在同源区域特异性的结合，在RISC的核酸酶功能的作用下，对其mRNA与siR

5、NA中反义链互补结合部的3端和5端切割，切割位点间的mRNA迅速被降解。现已证实Smo基因的高表达与多种肿瘤的发生有关，如：胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和基底细胞癌等。近期本实验室相关研究结果显示，Smo、Gli蛋白及mRNA在食管鳞癌细胞中高表达；Smo高表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关；SmosiRNA可抑制食管鳞癌的浸润和转移。可见Smo与食管癌的发生发展有关。本研究采用不同浓度SmosiRNA转染食管癌EC9706细胞，筛选出对Smo表达抑制效应最强的SmosiRNA序列、浓度和作用时间后，构建裸鼠食管癌移植瘤模型，即将

6、浓度为250ng／}tl的SmosiRNA．1转染食管癌细胞72h后收集细胞，调节浓度为1x107／ml，以裸小鼠背部肩胛旁区作为注射点，分别皮下注射0．2ml。采用免疫组织化学及Westemblot技术检测各组瘤组织中Smo及Glil蛋白的表达；采用组织原位杂交及RT-PCR技术检测各组瘤组织中Smo及GlilmRNA的表达；采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，采用透射电镜对凋亡细胞的超微结构进行观察，为分子靶向治疗食管癌提供实验基础和理论依据。材料和方法1．人食管癌EC9706细胞株来自于中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室惠赠；Balb／c裸

7、鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。2．分组转染：设24h、48h和72h三个转染时间段，每个时间段均设150ng／I_tl、200ng／I-tl和250ng／I_tl三个转染剂量，将特异性siRNA．1、siRAN．2及siRAN．3分Ⅱ摘要别转染EC9706细胞，结果显示250ng／I_tl、siRNA．1和72h组抑制效应最强，并将此组细胞构建为裸鼠食管癌移植瘤实验组。3．裸鼠食管癌移植瘤模型构建：将裸鼠分为3组，每组5只分别为：siRNA干扰组、无关序列组和空白对照组，以肩胛下为注射点，分组皮下注射各组细胞，构建裸鼠食管癌移植瘤模型。4．采用

8、免疫组织化学及Westernblot方法检测各组瘤组织Smo及Glil蛋白的表达情况。5．采用组织原位杂交及RT．PCR技