热休克蛋白90β对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

《热休克蛋白90β对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中农业大学硕士学位论文热休克蛋白90β对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响姓名：王少华申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：方六荣201206热休克蛋白9013对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响摘要猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PImSV)引起的一种危害养猪业的传染病，临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍和断奶仔猪的呼吸道症状。1987年美国首次发现该病，1996年郭宝清、陈章水等人证实我国猪群存在PRRSV感染。目前，该病已遍及世界的主要养猪国家和地区，对养殖业造

2、成了巨大的经济损失。热休克蛋白(heatshockproteins，Hsp—s)是一种在热休克、病原微生物感染等应激条件下，细胞产生的对自身起保护作用的蛋白质。Hsp．S是一种高度保守的蛋白质家族，广泛存在于真核生物和原核生物中。作为伴侣分子，Hsp．S主要参与蛋白质的正确折叠、转运以及促使未正确折叠蛋白质的降解，从而参与细胞信号转导、免疫应答、生物进化等。按照分子量大小，分为Hspl00、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小Hsp家族。Hsp90在细胞内蛋白质构象的成熟中起重要作用，并且又是许多病毒蛋白合成的重要伴侣分子。为了阐明Hsp90在PRRSV复制过程中所扮

3、演的角色，进行了以下研究：1．PRRSV感染促使Hsp90p的变化用PRRSVWUH3株分别感染Marc．145细胞和PAM细胞，通过相对荧光定量PCR和WestemBlotting，检测Hsp9013在mRNA水平和蛋白表达水平上的变化，发现PRRSV在两种细胞中均能引起Hsp90p表达的上调。2．Hsp90特异性抑制剂17．AAG对PRRSV增殖的影响根据17-AAG对Marc．145细胞的毒性实验结果，以及17一AAG对PRRSV增殖的抑制效果，选用17。AAG终浓度为5州作为后续实验的使用浓度。在病毒复制早期的不同时间点加入17．AAG，发现抑制剂均能显著抑制P

4、RRSV的增殖和Nsp2的表达，并且以PRRSV感染早期加入17．AAG的抑制效果最显著，说明抑制剂主要是在PRRSV复制的早期起作用。此外，PRRSVWUH3株感染Marc。145细胞，17．AAG处理后，通过蚀斑实验和WesternBlotting实验，发现17．AAG在12h、24h、36h、48h均对PRRSV的增殖有抑制作用，并且显著抑制Nsp2的表达。3．Hsp90干扰分子对PRRSV增殖的影响为了从正面证实Hsp90在PRRSV增殖中的作用，设计合成针对猴源Hsp90[3和猪源Hsp90的干扰分子，通过WesternBlotting和相对荧光定量PCR实验

5、证实设计华中农业大学20t2届硕士学位论文的干扰分子能有效抑制相应基因的表达。然后，将各干扰分子分别转染Marc．145细胞和PAM细胞，PRRSV感染后，通过蚀斑实验和WestemBlotting检测发现干扰Hsp90后均能抑制PRRSV的增殖和Nsp2的表达。4．17．AAG对PRRSV非结构蛋白表达的影响Nsp2具有半胱氨酸蛋白酶(Cysteineproteinse，CP2)活性，介导Nsp2／Nsp3切割，并且Nsp2和Nsp3均是PRRSV复制和转录的必需蛋白；而Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶，并与非结构蛋白Nspl0、Nspll、Nspl2共同形成复制酶

6、复合体(ReplicaseComplex)，负责动脉炎病毒基因组的复制及亚基因组的转录。为了研究17．AAG对PRRSV非结构蛋白表达的影响，将Nsp2、Nsp3、Nsp9、Nspl2分别连接到真核表达载体pCAGGS．HA上，构建了真核表达质粒，瞬时转染Marc．145细胞，WestemBlotting检测17．AAG对非结构蛋白表达的影响，结果表明抑制剂能够显著抑制Nsp2的表达，而对Nsp3、Nsp9和Nspl2的影响不显著。5．17-AAG对NF-r,B信号通路的影响NF．r,B信号通路在PR_RSV复制过程中发挥重要作用，在证实17．AAG能够抑制PRRSV增

7、殖的基础上，通过双荧光素酶报告系统检测发现PRRSV能够激活NF．rd3，而17．AAG则抑制PRRSV诱导的NF．KB激活。关键词：PRRSV；热休克蛋白90；17．AAG；Nsp22热休克蛋白9013对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PggS)，inducedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，isaseriousinfectiousdiseasesharmfu