猪ifitm家族基因的克隆及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

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1、华中农业大学硕士学位论文猪IFITM家族基因的克隆及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响姓名：李平申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：方六荣201206猪IFITM家族基因的克隆及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响摘要干扰素(Interferon，IFN)是一类由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性，现已广泛用于人医临床多种疾病的治疗，但干扰素的抗病毒作用并不是直接杀伤或抑制病毒，而是通过与细胞表面受体相互作用，诱导干扰素刺激基因(IFNstimulatedgenes，ISGs)表达多种

2、抗病毒蛋白，从而抑制病毒的感染与复制。IFITM(Interferoninducedtransmembraneprotein)蛋白基因家族是最早被确定的干扰素诱导基因(族)之一，包括IFITMl、IFITM2、IFITM3三个功能性成员，分别编码14．6、14．5和13．9kDa的蛋白，这些蛋白在抗病毒、诱导细胞分化、抗肿瘤、免疫监视方面起着显著作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是动脉炎病毒属的成员，引起猪的繁殖与呼吸综合征(Porcin

3、ereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，该病白1987年发生以来一直严重危害着世界养猪业，筛选有效的抗病毒基因有望为PRRSV的防控提供新的思路。为此，本研究主要克隆了猪IFITM基因并对其与PRRSV的相互作用进行了研究(本研究中猪IFITM基因指猪IFITMl，IFITM2，IFITM3三个基因)，主要内容如下：1．猪IFITM基因的扩增、序列分析及进化树的绘制通过对已知的其他物种IFITM基因的序列进行比对分析，预测了猪IFITM家族基因序列，并根据预测的序列分别设计特异性引物，从PK．1

4、5细胞中通过RT-PCR扩增获得猪IFITM基因。经测序分析发现猪IFITM家族的核苷酸序列全长分别为375bp、435bp、438bp，分别编码124、144、145个氨基酸残基，猪IFITMl与牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分别为71％、64％、57％、56％；猪IFITM2与牛、人、鼠的氨基酸序列同源性分别为76％、68％、54％；猪IFITM3与牛、人、鼠、猴的氨基酸序列同源性分别为73％、69％、62％、56％。系统进化树分析表明：不同物种IFITM家族的氨基酸序列存在较大差异，其中猪IFITM与牛IFITM的亲缘关系最近。2

5、．猪ⅡIⅡM的亚细胞定位将猪IFITM基因家族的3个成员分别克隆至pEGFP．C2中，构建真核表达质粒pEGFP．C20lFITMl、pEGFP-C2一IFITM2、pEGFP-C2-IFITM3，转染PK-15、293细华中农业大学2012届硕士学位论文胞，DAPI染色，激光共聚焦显微镜下观察，发现猪IFITM家族定位于细胞膜。3．猪IFITM家族对PIuRsV增殖的影响将构建的IFITM基因的真核表达质粒分别转染SJPL细胞和CDl63．293细胞，然后接种PRRSVWUH3株，并于接毒后24h收毒，绝对定量和空斑试验检测PRRSV的

6、增殖情况，结果证实猪IFITM家族显著抑制PRRSV的增殖4．PRRsV感染对猪邛．I-I'M家族的影响将pEGFP．C2．IFITMs真核表达质粒转染Mare．145细胞，接种PRRSV，DAPI染色，激光共聚焦显微镜观察，发现PRRSV感染不改变猪IFITM家族在细胞中的定位。用PRRSV感染PAM细胞，相对定量分析PRRSv感染对猪IFITM基因表达的影响，发现PRRSV在感染PAM细胞后9h能诱导猪IFITM基因的表达。关键词：IFITMl；IFITM2；IFITM3；进化树分析；亚细胞定位；PRRSV猪IFITM家族基因的克隆及

7、其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响AbstractInterferon(IFN)iscytokine，producedbymonocytesandlymphocytes．Interferonhasavarietyofbiologicalactivities，includingantiviralactivity，influenceoncellgro、^也，differentiation，andimmuneregulation．TheantiviralactivityofinterferondosenotOCCUrbydirectlykil

8、lingorinactivatingthevirus．However，itCaninhibitvirusreplicationbyinducingtheexpressionofmultiple