全麻药调控脊髓抑制性氨基酸受体机制及功能研究

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1、中国科学技术大学博士学位论文全麻药调控脊髓抑制性氨基酸受体机制及功能研究姓名：杨传秀申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：徐天乐20051001中国科学技术大学博士学位论文摘要全麻药是一类化学结构差异较大的药物，在I临床上使用已有150多年的历史，然而至今我们对其作用机制仍知之甚少，一般认为全麻药主要是通过直接与蛋白质相互作用而发挥作用的。在过去的二十年中，人们先后观察到近30种存在于神经元膜上的离子通道受到临床浓度全麻药的调控。但是，要将离子通道和受体的功能变化与全麻药的终端行为学效应联系起来，仍然是巨大的挑战。低浓度

2、巴比妥类全麻药诱导的痛觉过敏(hyperalgesia)现象，40年前就已被Clutton．Brock观察到，但其机制一直不清楚。近年越来越多的研究结果提示，作为痛觉信号加工处理的初级中枢，脊髓至少在全麻的两个终端行为学效应中发挥关键性作用：对伤害性刺激的制动(immobility)和镇痛(analgesia)。因此我们推测，巴比妥类全麻药诱导痛觉过敏的解剖基础也在脊髓。另一方面，已有大量实验证明，在痛觉信号的加工和处理过程中，GABAA受体发挥着至关重要的作用；而另一种主要的抑制性受体一甘氨酸受体在痛觉调控中的作用并不清楚。

3、不久前，Ahmadi和Harvey等证实，炎症情况下，中枢释放的前列腺素E2主要是通过作用于分布在脊髓背角表层的Ⅱ3亚型甘氨酸受体来发挥痛觉过敏效应的。这说明甘氨酸受体，至少是甘氨酸受体的部分亚型也直接参与了痛党和痛觉过敏的调控。此外，甘氨酸受体在全麻中的作用一直以来都未受到重视，原因是它们主要分布在脊髓和脑干，而以往人们认为高位中枢才是全麻药的主要作用靶点。在本研究中，我们以硫喷妥钠(thiopental)；为静脉全麻药的代表，应用全细胞膜片钳、生物化学、分子生物学以及行为学等技术手段，深入分析其对脊髓背角神经元甘氨酸和GA

4、BAA受体的调控机制，并进一步探讨甘氨酸受体在巴比妥类全麻药所致痛觉过敏中可能发挥的作用。主要实验结果如下：1．硫喷妥钠增强脊髓背角神经元GABAA受体功能和GABA能抑制性突触传递在急性分离的脊髓背角神经元上，在一50mV的钳制电压下，高浓度的硫喷妥钠直接激活氯离子通道，诱导内向电流，激活电流的阈浓度大约为50¨M。硫喷妥钠诱导的电流对GABAA受体阻断剂bicuculline很敏感，但对甘氨酸受体阻断剂strychnine不敏感。临床相关浓度的硫喷妥钠显著增强非饱和浓度GABA诱导电流的幅度，并延长GABA诱导电流的脱敏和

5、去活化时问常数。与此相反，较高浓度中国科学技术大学博士学位论文的硫喷妥钠反而抑制GABA诱导电流的幅度，这可能是由于开放的通道被阻塞造成的(openchannelblocker)。另外，30肚M的硫喷妥钠延长GABA能微小抑制性突触后电流(mIPSC)的时程。这些实验结果提示硫喷妥钠增强GABA能抑制性突触传递。2．硫喷妥钠和戊巴比妥钠通过不同的分子位点调控GABAA受体硫喷妥钠和戊巴比妥钠具有非常相似的化学结构，但它们的临床效能却相差很远，因此我们进一步检测了硫喷妥钠和戊巴比妥钠在GABA。受体上的相互作用。30p．M的戊巴

6、比妥钠可明显增强GABA诱导电流的幅度，但对硫喷妥钠诱导的最大电流没有影响。相似地，戊巴比妥钠诱导的最大电流也不受低浓度硫喷妥钠的调控。然而，300gM的戊巴比妥钠和200州的硫喷妥钠共同诱导的电流的幅度是它们各自诱导电流幅度的线性总和。另一方面，在最大增强GABA诱导电流效应浓度的硫喷妥钠存在的情况下，戊巴比妥钠不再增强GABA诱导电流的幅度，反之亦然。这些实验结果提示硫喷妥钠和戊巴比妥钠可能通过结合于GABAA受体上的不同位点来发挥它们的“拟似GABA”效应，但通过相同的位点来发挥它们的“GABAA受体调控”效应。3．硫喷

7、妥钠亚基依赖性抑制甘氨酸受体功能与痛觉过敏在急性分离的脊髓背角神经元上，硫喷妥钠抑制甘氨酸诱导电流的幅度，加快电流的脱敏，但减慢电流的去活化，洗脱共给的高浓度硫喷妥钠(300uM)，出现明显的尾电流。此外，甘氨酸受体的低亲和力激动剂一牛磺酸诱导的电流也明显被硫喷妥钠抑制。在HEK293细胞上，硫喷妥钠降低不同亚型的重组甘氨酸受体介导的电流的幅度，其中，对于旺3亚型甘氨酸受体，即使硫喷妥钠的浓度低至3laM也有明显的抑制效应。洗脱高浓度的硫喷妥钠，类似于天然的甘氨酸受体上的尾电流仅出现在(12亚型甘氨酸受体上，晓明硫喷妥钠调控甘

8、氨酸受体具有明显的亚基选择性。硫喷妥钠降低背角神经元甘氨酸能mIPSC的时程和频率。此外，脊髓鞘内(蛛网膜下腔)同时注射5微克硫喷妥钠和100微克甘氨酸几乎完全消除单独注射5微克硫喷妥钠诱导的痛觉过敏。这些实验结果提示甘氨酸能反应参与了硫喷妥钠诱导的痛觉过敏，d3亚型的甘氨酸