鸡leptin受体基因调控途径及功能研究

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1、分类号：密级：学号：2010208005单位代码：10759石河子大学博士学位论文鸡Leptin受体基因调控途径及功能研究学位申请人班谦贾斌教授指导教师刘小军教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向分子遗传与动物育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月StudyonLeptinReceptorGeneRegulatoryPathwaysanditsPhysiologicalFunctionsinChickenShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAg

2、ricultureByQianBan(AnimalGenetics,BreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Prof.BinJiaandXiaojunLiuJune,2013课题来源本课题主要受石河子大学绿洲学者项目《新疆地方鸡种质资源的发掘和利用》支持摘要Leptin基因序列于1994年首次在小鼠和人类上被报道以来，其在哺乳动物生理功能的研究已经取得了显著的进展，具有调节能量和脂肪代谢，影响采食量，调节繁殖性状，影响免疫等多种生物学功能，尤其是其作为调节能量、脂肪、采食的启动基因之一，具有极高的应用价值。而家禽Leptin基因的研究相对

3、进展缓慢，最大的制约因素是禽源Leptin是否存在未有定论。有多个报道声称其成功克隆到Leptin基因序列；但同时也有多个实验室在相同条件下不能重复前者的实验。质疑者的主要依据是克隆到的Leptin序列同哺乳类相似度极高，甚至超过了哺乳动物之间Leptin基因序列的相似度；而且自鸡的基因组测序工作完成以来，也一直无法在基因组中检索到已报道的Leptin基因序列。而鸡Leptin受体基因（cLEPR）序列和基因表达是肯定存在的。目前已经发现了其两种异构体存在，LEPR在哺乳动物上，作为Leptin基因的受体基因，对Leptin功能的发挥起到至关重要的作用，参与了多个代谢通路的调控。如果在鸡的基

4、因组中不存在Leptin基因，一切有关鸡Leptin功能的研究除证明鸡Leptin受体的存在外，没有任何生理上的重要意义。因此cLEPR是否是孤儿受体？如果不是孤儿受体，其生理功能是什么？就成了当前研究亟待回答的问题。本研究将从已经肯定的鸡cLEPR入手，探讨其生理功能，分析其调控路径，试图从另一个侧面对Leptin基因的争议提供受体方面的证据，为进一步将cLEPR基因应用于家禽生产和分子育种打下基础。本研究采用了RNAi、荧光定量PCR、转基因等技术对家鸡Leptin受体（cLEPR）基因及其调控通路进行了深入分析，在分子、细胞和个体水平上对cLEPR的调控途径和生理功能进行了研究，获得结

5、果如下：1.重复鸡Leptin序列扩增，不能获得目的片段：选择42日龄艾维茵肉鸡为研究对象，采集了肌肉、脂肪、脑、肝脏、血液样本，参考相关克隆到鸡Leptin基因的文献所报道引物，并自行设计一对引物对Leptin基因在转录和基因组水平上进行了扩增，均不能扩增到鸡Leptin序列。2.对42日龄艾维茵肉鸡LEPR基因表达量进行了荧光定量PCR检测：LEPR基因在肌肉、脂肪、脑、肝脏四类组织中均有表达，其中肝脏组织表达量最高，脑组织、脂肪组织次之，最后是肌肉组织，表达量个体差异较小，相对表达稳定，但基因整体表达丰度均不高。3.在细胞上证实了cLEPR抑制能激活STAT3/SOCS3通路：构建了艾

6、维茵肉鸡前脂肪细胞体外培养体系，设计了4个shLEPR干扰片段对LEPR基因进行了干扰，分析LEPR、JAK2、STAT3、SOCS3、AdipoR2、CPT-1、STK11基因表达变化，结果显示，合成的4个shLEPR干扰片段干扰效果均较好，其中以shLEPR-1片段最佳，干扰效率超过99%。干扰后，发现JAK/STAT代谢通路中STAT3/SOCS3信号转导途径因LEPR表达下调而被激活，STAT3、SOCS3基因表达均明显提升；I研究所涉及的其余基因及通路变化则不明显，且由于CPT-1等基因的稳定性表达，各组间细胞增殖速度也未见差异。4.在个体上发现CPT-1、AdipoR2、NPY的

7、调控存在非Leptin依赖途径：采用禁食方式处理实验用艾维茵肉鸡20只，分别于17、23、28、33日龄采集各5只样本，设立对照组，分析相关基因表达量，结果显示：禁食时间设置为3天效果良好，禁食组体重出现下降。LEPR、CPT-1、STAT3、AdipoR2、NPY基因在17-33天饲养期间均未出现随时间变化而出现显著的差异表达变化，CPT-1、AdipoR2、NPY基因表达量持续平稳，STAT3、LEPR基