ssh技术筛选家蝇抗感染差异基因及抗菌肽时相表达模式研究

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1、广东药学院硕士学位论文其功能如下：①抗细菌研究发现cecropins，drosocin，attacins，diptericin等有[14-15]抗G-菌的作用，defensin，metchnikowin有抗G+菌的作用。②抗病毒用针刺，冷冻免疫诱导后家蝇的抗病毒活性明显升高。另外，RNAi能控制体内病毒复制，产[16]生针对病毒的宿主敏感性部位的Dcr-2。③抗真菌Drosomycin，Metchnikowin，Cecropin，AFP等有抗真菌作用。④抗肿瘤家蝇幼虫和蛹的抗菌肽对人髓样白血病细胞（Ｋ562）有杀伤作用。舍蝇分子量分别为4kD、9

2、.6kD的抗菌肽，能有效地抑制人胃癌细胞MGC80-3和BGC-823，人乳腺癌细胞MCF-7及人肺癌细胞SPC-A-1的体外增殖，并呈浓度依赖关系。⑤抗原虫家蝇血淋巴中抗菌肽有杀伤弓形虫速殖子的作用。HuC等首次发现采采蝇中抗菌肽参与锥虫感染。表现出(Imd)pathway转录激活因子Relish的分子结构和果蝇有高度氨基酸相同性和结构相似性。通过双链DNA干扰，抗原诱导的抗微生物肽attacin、cecropin的表达受Relish的调节，但采采蝇中diptericin的表达不依赖Rel因子。GmmRel敲除后能够阻断attacin和cecr

3、opin在脂肪体和前胃中的诱导表达，同时attacin和relish的表达敲除后，中肠[17]和唾液腺椎虫感染率有意义的升高。目前在发现抗菌肽的多种作用机制中，膜攻击理论被认为是抗菌肽的最主要作用途径，然而同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用。目前认为的的作用机制主要包括：①胞膜攻击作用大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡。②对癌细胞骨架的断裂作用Chen等研究了天蚕素B、B1和B3的抗肿瘤作用机制，通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现，他们都可以使细胞的双分子层发生

4、溶解，微管崩解，肿瘤细胞皱缩、死亡。证实了抗菌肽不仅可以使细胞膜发生穿孔，而且还可以破坏微管的正常功能，影响细胞骨架的完整性，阻止纺锤丝形成和有丝分裂，[18]进而破坏细胞器，杀伤肿瘤细胞。③抑制蛋白质及细胞壁合成有学者对麻蝇毒素的作用机制提出了抑制细胞壁形成学说。Carlsson等提出了有关attacins抑制细胞外膜蛋白合成的学说，认为这类抗菌肽的作用模式可能是抑制了细菌细胞外膜一些重要蛋白的合成。attacin能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白基因的转录，使这些蛋白质含量减少，从而导致细胞膜的通透性增加，细菌的生长受到抑制。④诱导细胞凋亡。⑤线粒

5、体攻击作用。⑥对细胞核染色体的影响。丝氨酸蛋白酶昆虫体内丝氨酸蛋白酶是一个大家族。这些丝氨酸蛋白酶大多数3广东药学院硕士学位论文出现在血淋巴内，通过血细胞表达，其表达模式有助于揭示激酶激活体液防御应答的作用。果蝇的基因组内的丝氨酸蛋白酶由199个基因构成。这些基因某一组与免疫应答有关，主要涉及信号和激酶放大，导致特异性防御机制的激活，如黑化、凝[19]集和诱导抗菌肽表达。丝氨酸蛋白酶常由几个成分构成，它们受丝氨酸蛋白酶抑制剂的调节，限制临近位点反应，防止可能导致昆虫死亡的一种非控制系统的应答[20]。通过消化蛋白酶的方法区别丝氨酸蛋白酶主要结构特

6、征为调节氨基末端区域带有其他功能的结构域，此结构域可能与调节有关。这些结构域多数是一种片层结构[21](clip)，它由六个半胱氨酸构成一个保守空间，将丝氨酸蛋白酶接近一个昆虫伤口，这种clip结构域在蛋白与蛋白，蛋白与细胞外基质之间，具有激活作用。酚氧化酶酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)分布于蝇类体内，一般以无活性的酶原存在，被酚氧化酶激化酶激活后，其终产物为黑色素，沉积在病原微生物或者寄生虫的周围，与体节一起形成机械屏障以阻挡其入侵，也可以对病原体产生毒性作用。PO有三种形式：颗粒型PO(granularPO)、漆酶型P

7、O(1accase—typePO)、损伤型PO(injuryPO)。颗粒型PO在正常发育过程中通过合成黑色素而改变昆虫的体色；漆酶型PO则参与了新表皮的硬化反应；损伤型PO在昆虫受到伤害时通过合成具有细胞毒性的醌而对入侵微生物产生杀伤作用。黑腹果蝇的PPO有两个亚单位PPO1和PPO2，家蝇幼虫的PO为320ku，蛹的PO为330ku。酚氧化酶是以酚氧化酶原的形式存在于血淋巴、表皮及中肠中。研究证明，PO[22]存在于节肢动物的血细胞、血浆或同时存在于血细胞和血浆中。此外，一些研究者还观察到PO分布在其他组织中，如新形成的表皮和蜕皮前的表皮，中肠

8、上皮中的分泌颗粒和溶酶体。PPO活化形成PO的机制一直在研究之中。现一般认为是通过特异性丝氨酸蛋白酶级联反应被活化的。当昆虫受到外界微生