水稻淀粉合成关键酶基因的克隆及分子调控研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文水稻淀粉合成关键酶基因的克隆及分子调控研究姓名：张建申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：程备久;夏勉20080201摘要淀粉是许多粮食作物的种子、马铃薯块茎及多种植物块根的主要组成成份，在人类生活中起着举足轻重的作用。开展淀粉合成相关基因的研究是阐明淀粉合成机理以及利用基因工程改良淀粉品质的基础，具有重要的理论和应用价值。本文根据发表在GeneBank中的基因序列，设计特异性引物，利用RT-PCR方法，从粳稻品种日本晴未成熟种子的eDNA中克隆到完整的水稻淀粉粒结合型淀粉合成酶(Granule-boundstarchsy

2、nthaseI，GBSSI，即Wf6ⅨY)蛋白质编码区eDNA及完整的水稻淀粉分支酶3(Starchbranchingenzyme3，RBE3)蛋白质编码区eDNA；利用PCR方法从粳稻品种日本晴基因组DNA中克隆到水稻Waxy基因和水稻RBE3基因的片段各一个。克隆的水稻Waxy基因蛋白质编码区(codingsequenceregion，CDS)eDNA全长1830bp，编码610个氨基酸。编码序列与已发表的水稻淀粉粒结合型淀粉合成酶I蛋白质编码区eDNA序列相比，核酸序列有两个核酸的突变，推导的氨基酸序列也有两个氨基酸的突变，但没有影响到蛋白质的正

3、常活性。从水稻基因组DNA中克隆到的水稻Waxy基因片段长206bp，与已发表序列完全一致。克隆的水稻RBE3基因蛋白质编码区(codingsequenceregion，CDS)eDNA全长2478bp，编码826个氨基酸。编码序列与已发表的水稻RBE3基因蛋白质编码区eDNA序列相比，核酸序列有两个核酸的突变，推导的氨基酸序列也有一个氨基酸的突变，但没有影响到蛋白质的正常活性。从水稻基因组DNA中克隆到的水稻RBE3基因片段长195bp，与已发表序列完全一致。利用获得的完整水稻Waxy基因蛋白质编码区eDNA及完整的水稻RBE3基因蛋白质编码区eDN

4、A，以克隆的谷蛋白A3基因(GluA3)启动子控制基因的表达，构建了这两个基因的过量植物表达载体；再根据siRNA选取原则，选择了水稻Waxy基因及水稻RBE3基因片段，分别以GluA3启动子和高分子量麦谷蛋白基因(翩价力启动子调控这两个基因的转录，构建了这两个基因的siRNA植物表达载体；构建了基因过量表达和RNAi结合的多基因表达载体。用农杆菌介导的方法对水稻品种中花11进行转化，获得了41株RBE3基因的RNAi转基因植株。PCR检测及Southern杂交分析转基因植株，表明抗除草剂基因(Bar)和目的基因均整合到水稻基因组中。半定量RT-PCR

5、检测显示RBE3基因的表达量明显降低。对转基因植株籽粒直链淀粉含量和千粒重分析表明胚乳中的直链淀粉含量有明显的提高，平均提高140％，单株最高提高了238％，而转基因水稻的千粒重显著降低，平均下降值47％。关键词：水稻WaxyRBE3RNA干涉遗传转化千粒重直链淀粉含量AbstractStarchisthemajorcomponentofyieldintheworld’Smaincropplantandthepredominantreservecarbohydrate．Starchplaysakeyroleinhumanactivities弱asour

6、ceofnutritionforhumansandanimals．andasafeedstockforindustry．Basedontherecentadvancesinthebiochemistryandmolecularbiologystudyofstarchbiosynthesiscalzyme$，manipulationofstarchqualitybygeneengineeringisinprogressinordertounderstandthemoleculareventsinstarchsynthesisandtoimprovesta

7、rchquantityandquality．Inthisresearch，theproteincodingregion(codingsequenceregion，CDSregion)officegranule—boundstarchsynthaseI(GBSSI．WAXY)andricestarchbranchingenzyme3(RBE3)havebeenisolatedandpurifiedfi'omrice．Forisolatethegenes，designedspecificoligonucletideprimersbasedonthesequ

8、enceofstarchbiosynthesisenzymegenesinGeneBank，t