甘油合成关键酶基因的克隆表达及其应用

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1、分类号：Q939.92单位代码：10720密级：公开学号：1107100103硕士学位论文甘油合成关键酶基因的克隆表达及其应用Cloning,ExpressionandApplicationofKeyEnzymeGenesforGlycerolSynthesisfromCandidaglycerinogenesandSaccharomycescerevisiae论文作者：刘小红指导教师、职称：陈文强教授诸葛斌教授学科、专业名称：植物学研究方向：植物生物技术二〇一四年五月陕西理工学院学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所

2、知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西理工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：年月日陕西理工学院学位论文使用授权声明本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西理工学院。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西理工学院。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；本人授权陕西理工学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫

3、描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□。（请在以上相应方框内打―√‖）作者签名：年月日摘要甘油不仅是生物中重要的功能物质，而且是一种重要的三碳醇类平台工业化合物，具有广泛的应用价值，在国防，医药，食品等行业都有重要的作用。近年来，甘油作为生产高附加值化合物的原料，如1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、环氧氯丙烷、聚羟基脂肪酸酯(PHA)等，而备受关注，其中1,3-丙二醇是世界公认的12种最有潜力的重要工业材料，可与对苯二甲酸聚合形成新型的聚酯材料PTT，是国际研究热点。本文在江南大学工业微生物与生物工程反应中心获得

4、的产甘油假丝酵母基础上对甘油合成关键酶基因进行克隆和不同宿主的表达，并对其在1,3-丙二醇生物合成中的应用进行探索。本研究利用PCR方法，分别以产甘油假丝酵母和酿酒酵母染色体DNA为模板，克隆获得3-磷酸甘油脱氢酶编码基因CgGPD和3-磷酸甘油酯酶编码基因ScGPP2，在对这两个关键基因的生物学信息进行了一系列分析的基础上，构建表达重组质粒pEtac-CgGPD，pEtac-ScGPP2和pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2。将所构建的表达重组质粒pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2转入E.coliJM109，获得重组菌E.coliJM109(pEtac-Cg

5、GPD-tac-ScGPP2)；经IPTG的诱导，SDS-PAGE电泳检测，表明重组蛋白表达正确；酶活性测定表明：与野生菌株中没有检测到相应的酶活相比，重组大肠杆菌中3-磷酸甘油脱氢酶酶活力为0.06U/mg蛋白，3-磷酸甘油酯酶酶活力为0.01U/mg蛋白；重组菌胞外被检测到甘油说明来源于酵母的甘油合成途径已成功构建于原核生物大肠杆菌中。以此研究结果为基础，将所获得的甘油合成关键基因CgGPD和ScGPP2转入产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌株中，构建可利用葡萄糖为底物的产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌(K.pneumoniae/pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2)，经

6、SDS-PAGE检测和酶活测定，结果表明，两个甘油合成基因在克雷伯氏菌中都成功表达，重组菌3-磷酸甘油脱氢酶酶活力为0.1U/mg总蛋白，3-磷酸甘油酯酶酶活力为0.02U/mg总蛋白；野生对照菌株中没有这两个蛋白的酶活性，表明该甘油途径在克氏工程菌中有效存在。对所构建的克雷伯氏重组菌株(K.pneumoniae/pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2)发酵生产1,3-丙二醇的性能进行了初步的考察。结果表明在以葡萄糖为底物发酵时，发酵液中一定量的甘油积累，可以诱导1,3丙二醇合成途径的启动。对克雷伯氏重组菌株生产1,3-丙二醇的发酵性能进行优化，表明糖浓度提高1%，1,3

7、-丙二醇的产量增加了2.15倍。i补加1%的甘油发酵结果表明，在以葡萄糖为唯一碳源的一步法生产1,3-丙二醇的发酵中，一定浓度的甘油，可以快速启动1,3-丙二醇的合成途径，缩短发酵周期，节省成本。通过对重组菌K.pneumoniae(pEtac-CgGPD-tac-ScGPP2)和野生克雷伯氏菌碳流代谢分析进一步证实：3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）和3-磷酸甘油酯酶基因（ScGPP2）的加入，在克雷伯氏菌中搭建了一座桥梁，使磷酸二羟丙酮转化为克雷伯氏菌可以利用的底物甘油，成功的完成了葡