江西省猪痘病毒的分离及其分子流行病学和血清学调查

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1、江西农业大学硕士学位论文江西省猪痘病毒的分离及其分子流行病学和血清学调查姓名：蒋新华申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：邓舜洲20120528摘要猪痘(Swinepox)是由猪痘病毒(Swinepoxvirus，SWPV)引起猪的一种温和或急性传染病，以皮肤发生红斑、丘疹、脓疱和结痂为特征，主要危害3月龄以内的猪，成年猪很少发生或症状轻微，也有关于猪痘病毒胎盘感染导致流产、死胎或初生仔猪发病的报道，呈世界性分布。猪痘可通过猪虱等的叮咬机械传播，与猪的饲养卫生条件差相关。由于猪痘给养猪业造成的直接损失较小，通常被忽视。本试验通过猪痘病毒的分离及其分子流行病

2、学和血清学调查，旨在了解江西地区猪群中猪痘病毒的感染情况，为今后开展猪痘的流行病学、病毒的生物学特性、猪痘病毒作为表达载体等的研究打下基础。1．猪痘病毒PCR检测方法的建立与应用根据GenBank上登录的猪痘病毒(登录号：AF410153．1)P35基因序列，设计并合成1对引物，扩增目的片段为975bp。以疑似猪痘的皮肤痘痂提取DNA，通过对反应条件的优化，建立了检测猪痘病毒PCR方法。特异性、重复性和敏感性试验表明，该方法特异性高、重复性良好、对模板的最低检测量为2．7x10899。以建立的PCR检测方法对收集自江西地区的55份疑似猪痘保育猪皮肤痘痂进行PCR

3、检测，结果有44份为猪痘病毒阳性，阳性率为80％，表明江西省猪群存在猪痘病毒感染。2．猪痘病毒分离及P35基因的同源性分析以PCR检测为猪痘病毒阳性的保育猪皮肤痘痂为病毒分离材料，采用PKl5细胞盲传方式进行猪痘病毒的分离，通过对PKl5细胞培养物进行猪痘病毒P35基因的PCR扩增和测序确定病毒分离的成功。从江西省分离到15株猪痘病毒，分别命名为SWPV-JX01～SWPV-JXl5。所有分离毒株在PKl5细胞上均不产生明显的CPE，感染的PKl5细胞均能连续传代，仅造成死细胞偏多、胰酶消化时间缩短。以分离株SWPV-JX07人工感染兔和小鼠试验，表明能在兔体内

4、增殖，不能在小鼠体内增殖。通过对分离毒株P35基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性比较分析，结果表明：(1)分离毒株间的核苷酸序列同源性为98．1％～100％，推导氨基酸序列同源性为98．2％～100％；(2)分离毒株与猪痘病毒(AF410153．1)的P35基因核苷酸序列同源性为96．6％"--'98．2％，氨基酸序列同源性为87．5％～88．5％。3．猪痘病毒P35基因的原核表达将猪痘病毒P35基因克隆至原核表达载体pGEX．4T_1，构建原核表达重组质粒pGEX．4T-P35，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS．PAGE分

5、析表明，表达产物分子量约为64kDa(GST蛋白26kDa，P35蛋白约38kDa)，与预期大小一致；通过蛋白纯化和浓摘要度测定，获得浓度约7001xg／mLP35重组蛋白；以纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠(70“g／次·只)，连续免疫三次后采血，抗体效价达到1：102400，表明该P35重组蛋白具有良好的免疫原性。4．猪痘病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及江西地区猪痘病毒血清学调查以P35重组蛋白为检测抗原包被96孔酶标板，建立了检测猪血清中猪痘病毒抗体的间接ELISA方法，该方法的最佳包被抗原浓度为101-Lg／mL，猪血清最佳稀释度为1：80，兔抗

6、猪IgG酶标二抗的稀释倍数为1：5000。以建立的ELISA方法对2006年～2012年江西地区258个养猪场的2530猪血清样品进行猪痘病毒抗体检测，结果．1045份为猪痘病毒抗体阳性，血清总阳性率为41．3％(1045／2530)；猪场阳性率为90．7％(234／258)；其中母猪、哺乳仔猪、保育猪和生长育肥猪的阳性率分别为46．1％(749／1625)、16．9％(40／236)、38．3％(175／457)和37．7％(80／212)，母猪群的猪痘病毒抗体阳性率最高。本实验结果表明江西地区猪群中存在较普遍的猪痘病毒感染。关键词：猪痘病毒；病毒分离；分子流

7、行病学；原核表达；血清学调查AbstractSwinepoxcausedbySwinepoxvirus(swPv)，whichistheetiologicagentofaskindiseaseofpigs，characterizedbygeneralizedpustularlesionsandassociatedwithhighratesofillness．Itoccursmainlyonfarmswithpoorsanitationandaffectprimarilypigslessthan3-months-oldpigs；adultpigsshowmilde

8、rsigns．Itism