华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析

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MoLECULAREPIDEⅧoLoGICALSURVEYANDGENETICVf!UUATIoNoFPoRCINECIRCoⅥRUSTYPE2INEASTERNCHINAXiaoQiSupervisor：Prof．YangQianProf．HeKongwangAThesisSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfdlmentoftheRequirementfortheMasterDegreeofVeterinaryMedicineCompletedinJune2012CommencementinJune2012 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者儒亲笔)签各叼力肛“刖日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。／保密口，在一L年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密函(请在以上方框内打“√”)。学位论文作者(需亲笔)导师(需亲笔)签名：五，戽多月∥日山忆年乡月占日 目录符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．ⅢABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．V第一篇文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一章猪圆环病毒2型的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．1病毒分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2病毒结构及生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3病毒的细胞培养特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。31．4PCV2的基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．5PCV2的基因型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42．1PCV2的流行情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．2PCV2的传染源、传播途径及易感动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53PCV2感染的临床表现及病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54PCV2致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65PCV2的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯66PCV2的防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8第二篇试验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．13第二章华东地区PCV2流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．1病料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．2病毒毒株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141-3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．4主要试剂及配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．5病料处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．6血清与病料组织中PCV2核酸的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．7引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析1．8PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．9PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。162结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。172．1样品PCR检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2不同省市样品PCV2检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．173讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．18参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第三章华东地区PCV2的遗传进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．1PCV2阳性样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．2细胞、血清和病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．3质粒和菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．4其他试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．231．5主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．6主要溶液及培养基的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．7pK．15细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2s1．8PCV2阳性样品处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2s1．9阳性样品中PC'V2的细胞分离增殖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2s1．10细胞分离毒株核酸的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。261．11细胞分离毒株的PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一261．12间接免疫荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．271．13PCV2细胞分离毒株全基因组PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．281．14PCV2细胞分离毒株全基因组的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一291．15PCV2细胞分离毒株全基因组的测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。321．16PCV2细胞分离毒株ORF2基因同源性分析、遗传进化树分析和氨基酸序列分析⋯332结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一342．1细胞分离毒株的PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．2间接免疫荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3S2．3PCV2细胞分离毒株全基因组PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3s2．4质粒酶切鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．5PCV2分离株的全基因组测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．6PCV2分离株与参考毒株的ORF2基冈同源性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37 目录2．7PCV2分离株与参考毒株的ORF2系统进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．392．8PCV2分离株与参考毒株的ORF2氨基酸序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．403讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4：!参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49 符号说明AmpicillinbasepairDulbecco’SModifiedEagleMediumhourkilobasemilliliterOpenReadingFramePhosphatebufferedsalinePolymerasechainreactionPorcinecircovirusPorcinecircovirustype2rotateperminuteSecondmilligmmopticaldensitymierolitermicrogramPostweaningmultisystemicwastingsyndromePorcinedermatisandnephropathysyndromemole／liter氨苄青霉素碱基对改进的Eagle培养基小时千碱基毫升开放阅读框磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应猪圆环病毒猪圆环病毒2型辕|食秒毫克光学密度微升微克断奶仔猪多系统衰竭综合征猪皮炎与肾病综合征摩尔浓度挪№一h妨札哪l曼腿蝌一脚。嗍∞此皇2一一M 摘要华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查及遗传变异分析猪圆环病毒病(Porcinecircovinlsdiseases，PCVD)包括由猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)引起的一系列猪病，例如断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)和猪皮炎与肾病综合征(Porcinedermatisandnephropathysyndrome，PDNS)等。PCV2_-主_要因其侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，继而造成继发感染，因此猪圆环病毒病给养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒引起了全世界兽医学者的普遍关注，相继进行研究。本研究对2009．2011年间采集自华东地区送检的疑似PMWS猪血液或组织样本进行PCR检测，掌握华东地区的PCV2流行情况；通过分离鉴定PCV2流行毒株和PCV2毒株的ORF2基因的比较分析，掌握PCV2地方株的多样性和特性。本研究包括两部分内容：1．应用PCR检测方法，对2009．2011年采集自山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市426份疑似PMWS猪血液和组织样品进行检测。结果显示，华东地区426份病料中，有230份为PCV2阳性，阳性率为54．0％；7省市送检的样品中均能检测出PCV2阳性样品，其中浙江阳性率最高为59．5％，福建阳性率最低为48．O％。结果表明华东地区猪群中普遍存在PCV2感染，且感染率较高。2．选取来自山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的24份Pcv2阳性病料，经处理后接种pK-15细胞，并进行传代。传代过程中用PCR对分离株进行鉴定，扩增PCV2特异性目的条带，证实获得了16株PCV2分离株。间接免疫荧光检测结果进一步证实了16株PCV2毒株在pK．15细胞中获得了增殖。通过对16株PCV2分离株进行全基因组序列扩增、克隆和测序，获得了16株PCV2分离株的全长基因组序列。对这16株PCV2分离毒株与24株代表·t生-PCV2毒株进行ORF2基因同源性分析、系统进化树分析和氨基酸序列分析。ORF2基因同源性分析结果表明，l6株PCV2分离毒株与GenBank中其他24株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于83．7％．100％之间，与华东地区21株 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析已知参考毒株的ORF2基因同源性介于88．o％．100％之问，16株Pcv2毒株之间的ORF2基因同源性为88．o％．100％。基因型分析结果显示，2009．2011#-华东地区PcV2毒株存在3个基因型，即PCV2a、PCV2b和PCV2d，PCV2d基因型相对PCV2a和PCV2b更为流行，但与地理位置无明显相关性；ORF2氨基酸序列分析结果表明，16株PCV2分离毒株与Cenaaak中其他24株已知参考毒株相比，ORF2编码的cap蛋白存在3个变异度较高的主要区域53—91aa、121．151aa和190．215aa，且相关抗原表位区域存在变异。这些突变位点是否影响病毒的生物学特性，还有待于进一步研究。通过本研究掌握了华东地区猪群中PCV2的感染状况和PCV2地方流行株的多样性和特性，为疫苗株的筛选提供科学依据，为有效防控猪圆环病毒病奠定了理论基础。关键词：猪圆环病毒2型；流行病学调查；分离鉴定；序列分析；华东地区IV MoLECULAREPIDEMIOLOGICALSURVEYANDGENETICVARIATIONOFPORCINECIRCOVIRUSTYPE2INEASTERNCHINAABSTRACTPorcinecircovirusdisease(PCVD)consistsofaseriesofswinediseasescausedbyPorcinecircovirustype2(PCV2)，mainlyincludingpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)andPorcinedermatisandnephropathysyndrome(PDNS)，andSOon．WithimmunosuppressioncausedbyPCV2infection，immunityofswinedecreasedandsecondaryinfectionprobablyoccurred，andPCVDhasbeenconsideredtohaveasevereeconomicimpactonswineindustry．Theimportanceofthisdiseasehasstimulatedveterinarianstoaimatit．Inthepresentstudy,inordertoknowthemolecularepidemiologyofPCV2infectioninEasternChina，426serumsamplesandtissuesamplesofpigswithPMWScollectedfrom2009to2011inEasternChinahavebeendetectedbyPCR；ThemainobjectiveofthisstudyWastocharacterizeanddeterminethegeneticdiversityofPCV2basedontheisolatesandcomparisonofORF2geneofisolates．Thisstudyincludestwoparts：1．Fourhundredandtwenty-sixserumsamplesortissuesamplesofpigswithPMWSobtainedfromdifferentregionslocatedin7provinces(Shandong，Anhui，Jiangsu,Shanghai，Zhejiang，JiangxiandFujian)inEasternChinafrom2009to201weredetectedbyPCRtest．Theresultsdemonstratedthat230of426sampleswerePCV2positiveandthepositiverateWas54．O％．ThesamplesofPCV2couldbetestedpositiveinallthe7provinces．Thehighestpositiverateis59．5％inZhejiangandthelowestis48．0％inFujian．Therefore，PCV2isprevalentinEasternChinawithahighlypositiverate．2．Twenty—fourPCV2-positivesamplesfrom7provinceswereinoculatedonpK一15cellstoisolateviruses．TheisolatedviruseswereidentifiedbyPCRandspecificfragmentV 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析WaSdetectedin16isolates．ThereslutsofindirectiIIlmunofluoresccnccaSsay(IFA)filmlerprovedthatthese16PCV2-positiveisolatescanproliferateinpK-15．Thecompletegenomesofallisolateswereamplified，clonedintovector,sequencedandanalysed．ThewholegenomesofORF2geneof16isolateswerecomparedwith24PCV2referencestrainsregisteredinGenBanktoconstructphylogenetictree，homologyanalysisandsequenceanalysisofaminoacids．Theresultsofhomologyanalysisdemonstratedthatthehomologybetween40PCV2strainswere83．7％to100％，thehomologybetween21strainsinEasternChinawere88．O％to100％，thehomologybetween16isolateswere88．0％to100％．ThephylogeneticanalysisindicatedthattherewerethreesubgenotypesoccuredinEasternChinafrom2009to2011，PCV2a，PCV2bandPCV2d．ThePCV2dwasmorepopularinEasternChinathanPCV2aandPCV2b．ButthedistributionofPCV2didnotshowapparentgeographicalcharacteristics．AndtheaminoacidsequencealignmentoftheeapsidproteinencodedbyORF2geneshowedChinesePCV2strainsexhibitedthreemajorregionsofgreaterheterogeneityatresidues53—91aa、121-151aaand190-215aaandsomemutationsintheepitopesresidues．However,thesemutationsaffectthebiologicalcharacteristicsofthevirusrequiresfurtherstudy．Inthisstudy，theepidemiologyandthecharacteristicsofPCV2inEasternChinahavebeenknowndetailed，whichprovidedthescientificbasisforscreeningvaccinestrainsandthetheoreticalfoundationforpreventionandcontrolofPCVD．KEYWORDS：Porcinecircovirustype2，epidemiologicalinvestigation，isolationandidentification，sequenceanalysis，EasternChinaVI 第一章猪圆环病毒2型的研究进展第一篇文献综述猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的极小的一类动物病毒。该病毒根据病毒的抗原性和基因组组成的差异分为PCVl和PCV2两个基因型【11。Tischcr等于1974年首次在pK-15细胞培养物中发现了PCVl，经研究证实，PCVl可持续感染pK．15细胞，但不引起CPE[181，虽然对猪没有致病性【21，但可使猪产生血清抗体【3】；对于PCV2的多项研究表明，该病毒是断乳仔猪多系统衰竭综合征(post—weaningmulti-systemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原【41。早在1991年，加拿大学者发现了断乳仔猪多系统衰竭综合征(post-weaningmulti-systemicwastingsyndrome，PMWS)，随后证明此病在全世界很多国家和地区都存在f5，6】，引起了全世界兽医学者的高度重视。我国的一些学者相继证实，PMWS也在国内一定地区广泛存在【7'8】。PMWS可引起断奶后和育成期仔猪，尤其是5．12周龄仔猪的进行性消瘦、皮肤苍白、黄疸、呼吸道症状、浅表腹股沟淋巴结肿大、腹泻和中枢神经障碍等临床症状，以及全身淋巴结炎症、肝炎、肠炎、肾炎和肺炎等病理变化，PMWS的发病率从4％至30％不等，病死率约为50—90％【10-1q。PCV2不但能引起PMWS，而且能引起幼龄仔猪的先天性震颤(Congenitaltremors，CT)、猪皮炎与肾病综合征(Porcinedermatisandnephropathysyndrome，PDNS)、母猪繁殖障碍综合征(SwineReproductiveDisorderSyndrome，SRDS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道病综合征(PorcineRespiratoryDiseaseComplex，PRDC)等疾病【12】。鉴于以上原因，PCV2已经对全世界养猪业造成重大危害，猪群不但面临PCV2较高的感染率，更为严重的是，由于PCV2产生的免疫抑制造成疾病频发，大大提高了饲养成本，降低了生产效率，严重威胁养猪业的健康可持续发展【13．H】。目前，国内外兽医专家学者对PCV2高度重视，深入研究PCV2的致病机理，倾注心血研发PCV2的预防药物，已取得一定研究进展。 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析1病原学1．1病毒分类国际病毒分类委员会(ICTv)在第六次学术报告会上命名了一个新的病毒科一圆环病毒科(circoviridae)；又将圆环病毒科分为两个属，分别是圆环病毒属和环病毒属。圆环病毒科病毒有一些共同的特征，例如都有一条单股闭合环状DNA链组成基因组，没有囊膜等。猪圆环病毒、鸡贫血病毒、鹦鹉喙羽病毒、鸽子的圆环病毒、鹅的圆环病毒等都属于圆环病毒科【I51。圆环病毒属的共性在于，一是有与滚环复制的启动相关的潜在环柄序列基元；二是在病毒正链与其互补链上有2个编码Rep与Cap蛋白的主要开放阅读框，Rep蛋白主要与病毒复制相关，Cap蛋白是病毒衣壳蛋白；三是同属成员复制相关蛋白的氨基酸同源性在41．2％．58．2％之间，同源性较高；四是公认的基因间隔区存在正向或反向的重复序列【l61。猪圆环病毒(PCV)就属于圆环病毒属。Niagro等t1。7】建议将圆环病毒分为以下3个群：似双病毒类嗜植物圆环病毒，包括SCSV、CFDV和BBTV；似双病毒类嗜动物圆环病毒，包括PBFDV和PCV；CAV和TTV因在结构上与其他圆环病毒差异较大，被列为另一类群。1．2病毒结构及生物学特性PCV2病毒由核酸和衣壳蛋白组成，无囊膜，正二十面体对称，直径约为17nm，沉降系数为52S，CsCI浮密度1．379／cm3。PCV2病毒的基因核酸分子量为0．58x104Da，长1767bp或1768bp，是一条共价结合形成的闭环单链DNA；其病毒衣壳蛋白分子量是3．6x104Da，是一条多肽链。PCV2病毒是迄今为止发现的极小的一类动物病毒。PCV2的包涵体分为包浆内包涵体和核内包涵体。胞浆内包涵体有两种类型，一种直径为0．1．0．5mm，呈颗粒状，无膜包围，跟周围的细胞质融为一体；另外一种较大，直径是0．3．5．0mm，呈圆形，有膜包围，电子密度大。总之，大多数胞浆内包涵体都分布在细胞核周围，呈圆形或者卵圆形。核内包涵体无膜包围，呈圆形、菱形或颗粒状，大小为0．1．1．0um，与网状核仁或异染色质的凝集物有关【241。PCV2属于对外界环境抵抗力较强的一类病毒，尤其是对恶劣的环境抵抗力较强，所以能够长期在猪场存在，影响相关疾病的防治【251。例如，PCV2对多种消毒剂的抵 第一章猪圆环病毒2型的研究进展抗力较强，在酸性环境以及氯仿中可存活较长时间，在70"C可以存活15rain。但是，PCV2对氢氧化钠、酚混合物、明(VirkonS)、次氯酸钠以及季胺盐混合物较敏感，特别是VirkonSt251。在血凝性方面，PCV2不凝集人、猴、猪、兔、小鼠及鸡的红细胞，无血凝性。1．3病毒的细胞培养特性PCV2病毒在部分细胞中可以体外复制。因为PCV2病毒的复制主要依赖细胞S期表达的蛋白，所以PCV2病毒比较适合在正处于有丝分裂期并具有旺盛生命力和繁殖能力强的细胞上增殖。PCV2在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK．21细胞上不能生长。PCV2虽然能在Vero细胞上复制，但是当连续传代时容易发生抗原性改变【2睨7】。一般采用无PCV污染的单层pK一15细胞培养PCV2。但是，由于PCV2培养后不产生CPE，所以需要添JJID．氨基葡萄糖处理，再借助PCR技术或间接免疫荧光方法等手段观察PCV2病毒增殖。具体做法如下：先在pK-15细胞上接种PCV2病毒，培养24h后，用300mmol／L的D．氨基葡萄糖处理30min，再培养48．72h后收毒。据部分学者报道，D．氨基葡萄糖可能能够提高宿主细胞S期合成的聚合酶的产量，或延长聚合酶的合成时间，从而达到提高PCV2的病毒滴度的目的【291。也有研究结果表明，如果不添}JIJD．氨基葡萄糖，也能用延长培养时间的方法达到同样的PCV2增殖效果【3⋯。1．4PCV2的基因组结构PCV2可分为两种基因型，其基因组全长分别为1767bp和1768bpt”】。PCV2的基因组包含ORFl．ORFl1共11个阅读框，ORFl和ORF2是PCV2的主要开放阅读框，基因组大小分别为945bp和702bp。研究表明，ORFl开放阅读框编码与病毒基因组复制相关的2个蛋白，分别是Rep和Rep’；ORF2开放阅读框编码的衣壳蛋白(Cap)形成了二十面体衣壳，是病毒唯一的结构蛋白【32】。ORF2基因可以克隆到杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中表达，其表达产物与纯化的病毒粒子中检测到的蛋白大小相似，电镜能观察到表达产物自动组装成病毒样颗粒，Nawagitgul等[321的这些实验进一步证实TORF2基因编码PCV2病毒的核衣壳蛋白具有良好的抗原性，同时也证明了ORF2基因是构建核酸疫苗的首选基因。 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析1．5PCV2的基因型多数学者认为，PCV根据其抗原性和基因组组成差异，分为两种血清型，PCVI和PCV2。Tischcr等于1974年首次在pK-15细胞培养物中发现TPCVl，经研究证实，PCVln--I持续感染pK．15细胞，但不引起CPE[181，可以使猪产生血清抗体【3】，但是对猪没有致病性【21，在猪群中广泛存在。AllanGM等【19】于1998年在患断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post—weaningmulti-systemicwastingsyndrome，PMWS)的猪群中首次分离到PCV2病毒，并证明了PCV2是引起PMWS的重要病原之一。进一步，有学者研究表明，对PCV2基因组的研究可将PCV2分为不同的基因型。一种观点认为PCV2还可以细分为PCV2．1和PCV2．2两种基因型，PCV2．1又称之为PCV2b，PCV2．2又称之为PCV2a[33J，同时认为PCV2．1&PPCV2b是PMWS的主要致病因素【20．221。但是，Opriessnig等学者认为PCV2a和PCV2b对SPF猪的致病力没有明显差异，相同亚型之间的致病力有所不同，在PCV2a与PCV2b间存在交叉保护力【23】。PCV2a和PCV2b两型之间基因组核苷酸和氨基酸的同源性在95％左右，两型ORF2之间基因组核苷酸和氨基酸同源性在90％左右；并在ORF2中存在可区分两型的特异性核苷酸序列，PCV2b为1486．TcA／aac／CCC／GG，PCV2a为AcC／aac／AAA／AT[34】。另有一种观点认为存在PCV2a、PCV2b和第三种基因型PCV2c，特别是中国大部分地区主要以PCV2b基因型为主，但是，不属于PCV2瘌PCV2b的基因型是否都属于PCV2c，有待证实【35】；第三种观点认为PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e五种基因型，我国存在PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2e四种基因型，且国内的流行基因型是PCV2b136·37]。2流行病学2．1PCV2的流行情况PMWS最早发生在1991年的加拿大，散发性，流行性发生的情况较少。目前，在许多国家和地区都存在PCV2广泛流行的现象，但流行状况差异较大。2000年PCV2在苏格兰的发病率为1．2％t381。2004年证明了PCv2已在英国存在30多年【39】。PCV2在美国、墨西哥、阿根廷等国的发病率和死亡率均较低，在美国和瑞典的传播速度缓慢。4 第一章猪圆环病毒2型的研究进展我国近十几年的流行病学调查数据表明，2000年在北京、河北、山东天津、江西、吉林、河南等7省市22个猪群的血清中，用ELISA方法检测到PCV阳性率为42．9％【7】；2002年北京、天津、广东、深圳、山东、山西等地11个规模化猪场[园PCV2发生PMWS，1个猪场发生PDNS；2006年PCV2在江苏地区162份可疑病料中的阳性率为44．4％【加】；2009年河南、湖南、湖北、浙江、陕西、福建、上海、重庆等11个省(市)的PCV2阳性率为28．9％【35】。以上数据表明，2000年以来，PCV2已经在我国广泛存在。2．2PCV2的传染源、传播途径及易感动物PCV2的主要传染源是病猪和带毒猪，PCV2可以通过粪便、分泌物等排到环境中。PCV2的传播途径有消化道、呼吸道、胎盘、乳汁、精液等【41以461，但是也有学者认为垂直传播不是PCV2在猪群中传播的主要途径t451。猪是PCV2的天然宿主，各年龄猪均易感，一般5．15周龄的断奶仔猪和早期育肥猪多发，仔猪断奶后2．3天开始发病。本病的诱因很多，断奶、气温变化剧烈、饲养密度大、饲养环境差、运输等免疫应激都可以成为本病的诱因。PCV2的易感动物不仅仅是猪，PCV2也可以在鼠中水平传播【441，且对小鼠有一定的致病性，这为研究该病毒的致病机理和建立合适的动物发病模型提供了理论依据。目前，仔猪作为PMWS的动物模型也获得了诸多研究成果。Gauger2011【481、Krakowka2000[491、Bolin2001[471、Harms2001t6】等的研究结果均表明，无特定病原体仔猪由于不易受到共感染因素及其它病原体的影响可以作动物模型用于PCV2的研究。且Andraud2009还建立了PCV2传染与时间的相关联的模型【501。3PCV2感染的临床表现及病理变化PCV2主要诱发PMWS等免疫抑制疾病，造成免疫器官衰竭【51】，临床主要表现渐进性消瘦、被毛粗乱、精神萎靡、淋巴结肿大、腹泻等特征。PMWS的组织病理变化主要表现在腹股沟和支气管淋巴结、扁桃体、脾脏、胸腺等组织器官。表现有淋巴细胞数量减少、单核巨噬细胞浸润，有时散布大量的多核巨细胞，淋巴结皮质及副皮质区扩张，有组织细胞浸润；淋巴滤泡中心部蜂窝状坏死，周围组织细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞聚集的炎性肉芽肿会引起这些器官的肿大，如脾脏肿胀，肾 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析脏肿大渊。4PCV2致病机理PCV2的致病机理目前尚不十分清楚，但也有一些突破。有些学者认为，PCV2感染妊娠期的不同阶段时，会对不同的组织、细胞表现出感染嗜性。Sanchez等(2003)报道，胎儿期的心肌细胞是PCV2的主要靶细胞，是其复制的主要场所【52】；胚胎后期至产后，巨噬细胞是PCV2的靶细胞群(Rome02003)[53】。Vincent等研究表明，多突起细胞(DC)不是PCV2的靶细胞或复制的位点，而是作为PCV2运输的媒介。也有学者认为，PCV2通过对猪免疫系统的影响而致病。Chang等(2005)研究发现，PCV2对猪免疫系统有明显的影响，造成强免疫抑制，引发感染或继发性免疫缺吲541。因此，PCV2常与其它病毒、细菌造成混合或激发感染，从而加重病情，影响其他疾病的免疫效果。可能是由于PCV2与其他病毒混合感染时，一种病毒的存在补充了另一种病毒的复制，或相同的生理因素使两种病毒的复制得到了增强。也有研究显示，免疫也会对疾病起促进作用。Resendes等(2004)认为，当对猪免疫系统给予刺激，如注射疫苗或者非特异性免疫调节剂，则有可能使PCV2复制增强而导致PMWS的发生，这一现象通常称为PCV2的免疫激剔55】。5PCV2的检测方法目前，仅通过PCV2的临床症状及病理变化难以鉴别诊断该病，而病毒分离与鉴定的方法又比较耗时，所以利用血清学方法和分子生物学方法对PCV2进行检测成为鉴定PCV2的主要方法。检测PCV2的方法主要有电镜法、间接免疫荧光实验(IFA)、免疫组织化学技术(mC)、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交技术(ISH)、免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)等。Walker(2000)D6J利用PCV．2特异性单抗建立了竞争ELISA检测PCv．2抗体的方法。Pomtippa(2000)建立了用杆状病毒表达的Cap蛋白检钡,qPCV．2实验感染猪血清抗体的方法【5踟。曹胜波等(2001)建立了PCV2的PCR检测方法【9】。Liu等(2001)[57】建立了用大肠杆菌表达的MBP．His．tag．ORF2融合蛋白检钡,tJPCV．2抗血清的方法，但表达量只占菌体蛋白的1％。6 第一章猪圆环病毒2型的研究进展韩凌霞(2004)【4】通过EUSA比较试验发现，截短的C印蛋白的抗原反应性比完整的Cap和Rep蛋白都强，是一个较好的PCV感染诊断用抗原，为建立新的PCV2诊断方法奠定了基础。6PCV2的防治PCV2感染可对养猪业造成相当大的经济损失，采用疫苗免疫与检疫是防制的主要方法。在从PCV2发现至今的数十年问，兽医科研人员在其病原学研究及分子生物学研究方面取得了较大进展，疫苗相继投入实验或生产阶段，但疫苗的安全性和保护力尚待进一步的研究。目前，PCV2的致病机理和免疫机制等方面仍有许多问题值得深入研究，良好的饲养管理仍是防控PCV2流行的主要措施。小结综上所述，面对PCV2巨大的危害性，研究和实施预防、控制该病的有效措施是当务之急。随着分子生物学等学科的飞速发展，我们对PCV2结构与功能的研究正在不断深入，该病的分子生物学诊断方法也正在日益完善。但是仍有许多问题尚不清楚，有待进一步研究。目前，如何开发出保护性好，且更加安全、稳定的新型PCV2疫苗已成为当今PCV2的研究热点，对于控制与消灭PCV2意义重大。 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华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析WastingSyndromebyInfectionofConventionalPigs、ⅣimPorcineCircovirusType2AloneorinCombinationwithPorcineParvovirus[J]．JournalofComparativePathology,2000，122(1)：9-24．【50】AndraudM，RoseN，GraslandB，eta1．Influenceofhusbandryandcontrolmeasuresonporcinecimovirustype2(PCV-2)dynamicswinlinafarrow-to-finishpigfarm：Amodellingapproach[J]．PreventiveVeterinaryMedicine，2009，92(1—2)：38-51．【51】FemandesLT，TomdsA，BensaidA，eta1．Microarrayanalysisofmediastinallymphnodeofpigsnaturallyaffectedbypostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．VirusResearch，2012，165(2)：134—142．[52】SanchezJrRES，MeersP，NauwynckHJ，eta1．Changeofporcinecircovirus2targetcellsinpigsduringdevelopmentfromfetaltoearlypostnatallife[J]．VeterinaryMicrobiology,2003，95(1—2)：15．25．【53】RomeoE，SanchezJR,PeterM，eta1．Changofporcinecircovirus2targetcellsinpigsduringdevelopmentfromfetaltoearlypostnatallife[J]．VeterinaryMicrobiology，2003，95：15-25．【54】ChangHW，JengCR,“uJJ，eta1．Reductionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)infectioninswinealveolarmacrophagesbyporcinecircovirus2(PCV2)一inducedinterferon-alpha[J]．VeterinaryMicrobiology,2005，108(3-4)：167·177．【55】ResendesA，SegalesJ，BalaschM，eta1．Lackofaneffectofacommercialvaccineadjuvantonthedevelopmentofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inporcinecircovirustype2(PCV2)experimentallyinfectedconventionalpigs[J]．VetRes，2004，35：83—90．【56】WalkerIW，KonobyCA，JewhurstVA，eta1．Developmentandapplicationofacompetitiveenzynle—linkedimmunosorbentassayforthedetectionofserulnantibodiestoporcinecircovirustype2[J】．JVetDiagnInvest，2000，12(5)：400-405．[57】LiuQ，WillsonP，Auoh—PokuS，eta1．BacterialexpressionofanimmunologicallyreactivePCV-2ORF2fusionprotein[J]．ProteinExpressionandPurification，2001，21(1)：l15—120．[58】Nawagitgul1P，MorozovI，BolinSR，eta1．Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[J]．JGenVirol，2000，81(9)：2281—2287．12 第二章华东地区PCV2流行病学调查第二篇试验研究摘要：PCV2主要引起PMWS，该病以多系统病理损伤和渐行}生消瘦为主要特征，在中国广泛流行，给养猪业造成了严重的经济损失。本实验应用PCR检测方法，对2009．2011年采集自山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市疑似426份PMWS猪血液和组织样品进行检测。结果显示，华东地区426份病料中，有230份为PCV2阳性，检出率为54．O％，7省市送检的样品均能检测出PCV2阳性样品，其中浙江阳性率最高为59．5％，福建阳性率最低为48．o％。表明华东地区猪群中普遍存在PCV2感染。关键词：猪圆环病毒2型；流行病学调查；华东地区ABSTRACT：Porcinecircovirustype2(PCV2)mainlycausedpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)，whichcharacterizedmultisystemicPathologicaldamageandprogressiveemaciated．PCV2iswidespreadinChina，andhascausedseriouseconomiclossestothepigindustry．Inthisstudy,426serumortissuesamplesofpigswimPMWSobtainedfromdifferentregionslocatedin7provinces，includingShandong，Anhui，Jiangsu，Shanghai，Zhejiang，Jiangxi，FujianofEasternChinain2009to201weredetectedbyPCRtest．Theresultsdemonstratedthat230of426sampleswerePCV2positiveandtherateWas54．0％．ThesamplesofPCV2couldbetestedpositiveinallthe7provinces．Thetli曲estpositiverateis59．5％inZhejiangandthelowestis48．0％inFujian．Therefore，PCV2isprevalentinEasternChinawi吐lahighlypositiverate．KEYWORDS：Porcinecircovirustype2，epidemiologicalinvestigation，EasternChinaPMWS属于免疫抑制性疾病，是危害养猪业的主要传染病之一。PMWS患病猪临床主要表现为生长发育受阻、皮肤苍白、黄疸、淋巴结肿大、呼吸道症状、腹泻等。13 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析目前研究结果表明，PCV2是引起PMWS的主要病原，而该病的发生和蔓延已给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国许多省份都对PCV2的流行情况进行了系统调查，2000年已有血清学和病原学证据表明我国猪群中存在PCV2感染【1。2】。本研究应用PCR检测方法，对我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市送检的426份疑似PMWS猪血液和组织样品进行PCV2检测，旨在了解华东地区PCV2的感染流行情况，为今后疫苗研制提供理论依据。1材料和方法1．1病料病料为2009．2011年间，采集自我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市426份疑似PMWS猪血清、脾脏、肺、肾、腹股沟淋巴结等。其中，来自江苏省120份、浙江省42份、安徽省95份、山东省74份、上海省35份、江西省35份、福建省25份。1．2病毒毒株PCV2标准阳性毒株PCV2Haian株(GenBank登录号：FJ712216)由本实验室保存。1．3主要仪器5804R台式高速大容量冷冻离心机；TP600梯度升降温功能PCR仪；JS．680B凝胶成像系统；101．510．001迷你垂直电泳仪；JJW-1KVA单项净化交流稳压器；HM．1水平电泳槽；SW-CJ．1FD超净工作台；电热恒温水浴锅；ZP．200振荡器；超纯水器；MDF．U32V(N)．70。C超低温冰箱；KK23v60TI．20。C低温冰箱。1．4主要试剂及配制DL2000Marker、rTaq聚合酶、蛋白酶K、dNTP均购自大连T水aRa生物工程有限14 第二章华东地区PCV2流行病学调查公司。1．2％琼脂糖凝胶：称取1．29琼脂糖溶于100mL1×吼垣电泳缓冲液中，加热溶解。酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)：取饱和酚25mL、氯仿24mL和异戊醇1mL，充分混匀后，用适量TE(pI-I8．0)覆盖，棕色瓶中避光保存。1．5病料处理取19病料组织用手术剪剪碎、研磨、制成匀浆后，力H5mLPBS，放入塑料管中，反复冻融3次，4。C8000rpm离。1二,8min，取上清，置于．70。C保存备用。血液样品经4000rpm离一1二,8min后，取血清，置于．70。C保存备用。1．6血清与病料组织中PCV2核酸的提取取处理好的样品400此于干净的Eppendorf管中，加／入4009Lff'J组织消化液(100mmol／LNaCl，10mmoULpH8．0Tris．HCl，25mmol／LEDTA，O．5％SDS)并混匀，然后加入蛋白酶K至终浓度为50099／ml，置于56。C水浴3d,时，用等体积的酚：氯仿：异丙醇(25：24：1)抽提2次，12000rpm离心10min，取上清，加两倍体积的无水乙醇沉淀，一20。C静置30min，12000rpm离一IL,10min，去上清，加入75％的乙醇清洗沉淀，12000rpm离一I二,10min，去上清，用509LTE重悬沉淀，．20。C保存备用。1．7引物根据GenBank中收录的PCVl(GenBank登录号：AF071879)和PCV2Haian株(GenBank登录号：FJ712216)序列，选取PCV2相对保守而不同于PCVl的序列，利用Oli906．0软件设计一对PCV2特异性引物，由上海英骏技术有限公司合成，引物序列如表2—1。引物扩增片段大小为722bp，用TE缓冲液配成适当浓度1009M，贮存于．20。C冰箱备用。 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析表2．1PCV2特异性检测引物Table2-IThePCRprimersfordetectionofPCV2F代表PCR正向引物；R代表PCR反向引物。F，forwardPCRprimer；,RreversePCRprimer．1．8PCR检测取病毒基因组DNA为模板，在PCR反应管中，按照以下体系进行扩增，总体积251xL，如表2—2。表2．2PCR扩增反应体系Table2-2PCRMixtureforamplificationofPCV2模板1此10xBufferSFORF2(20pmol／1．tL)SRORF2(20pmol／pL)aNTP(2．5mM)MgCl2rTaq酶ddH202．5止0．5此0．5止2此0．25旺16．25此反应程序：95℃预变·l生5min，1个循环；94"C变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸50s，共40个循环；最后72℃延伸10min。1．9PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定采用常规琼脂糖凝胶电泳进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为1．2％，含溴化乙锭0．25ug／ml，缓冲液为0．5×TBE，以100V衡压电泳40分钟左右紫外灯下观察结果。16 第二章华东地区PCV2流行病学调查2结果2．1样品PCR检测结果对华东地区7省市送检的426份疑似PMWS猪病料进行流行病学调查，检测出230份PCV2阳性病料，阳性率为54．0％。结果如图2．1所示，电泳结果显示阳性样品出现了与预期大小一致的特异性条带，大dxj‘J722bp，证明PCV2在这些地区的猪群中普遍存在和流行。bpMl2345620∞10007505∞2S01∞图2-l部分样品的PCR柏t测结果M：DL2000Marker；14；检测样品；5：阳性对照；6：阴性对照M：DL2000Marker：1-4：samples；5：Positivecontrolt6：Negativecontrol2．2不同省市样品PCV2检测结果对我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的426份血液和组织样品进行PCV2检测，结果如表2．3。 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析表2．3不同地区送检病料PCV2检测的阳性率Table2-3ThepositiveratesofPCV2insamplesfromdifferentregiolls3讨论PCV2在7．15周龄的后期哺乳猪和早期肥育猪群中多发，是引起PMWS的主要致病因素之一。剖检可见腹股沟淋巴结肿大、肾脏肿胀，有时可伴有胃溃疡导致的严重出血。临床症状以猪的渐进性消瘦、生长迟缓、呼吸困难、腹泻、贫血、皮肤苍白等为主。通过流行病学调查发现PCV2在我国已普遍存在【2吲，该病严重威胁着我国规模化养猪产业的健康发展。在我国，2000年郎洪武等首次对采集自北京等7省的559份血清进行了PCV2检测，PCV2阳性率为42．9％【l】。曹胜波等(2001年)用PCR方法对河南、广东等四省的43份病料进行了检测，阳性率为27．9％【3】。随着PCV2在我国的逐渐流行，已有多篇关于PCV2血清学和病原学的调查报告，结果表明，PCV2感染在我国各地已经广泛存在，猪群感染率高，阳性猪场多。为了确定华东地区7省市PCV2的流行和分布情况，本实验通过PCR方法对收集的不同省份送检的疑似PMWS猪病料进行了检测，426份病料中共检测到230份PCV2阳性病料，阳性率为54．0％。实验结果表明华东地区7省市PCV2己普遍存在，且感染率较高，这与李文洁等【9】和“等㈣研究结果相符。华东7省市中，浙江、江苏和江西省的PCV2阳性率高于平均阳性率，且浙江和江苏的阳性率较其他省市偏高，但差 第二章华东地区PCV2流行病学调查别不是很大。19 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析参考文献【l】郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测【J】．中国兽医科技，2000，30(3)：3-5．【2】郎洪武，王力，张广川，等．猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰竭综合征的诊断[J】．中国兽医科技，2001，3(31)：3—5．【3】曹胜波，陈焕春．猪圆环状病毒2型的PCR检测方法的建立和应用[J】．武汉：华中农业大学学报，2001(1)：53—56．【4】芦银华，陈德胜，戴亚斌，等．应用复合PCR法检测猪圆环病毒[J】．中国兽医科技，2001，3l(9)：8-9．【5】王忠田，杨汉春，郭鑫．猪圆环病毒的最新研究进展【J】．猪的重要传染病防治研究新成果一一中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防疫专业委员会第7次学术交流会论文集．北京：中国农业大学，2002．【6】黄伟坚，芦银华，覃广胜，等．广西断奶仔猪圆环病毒2型的检测【J】．中国兽医科技，2003，33(1)：3-6．【7】向火育．武陵山区猪圆环病毒流行病学调查．【中国优秀硕士学位论文】．武汉：华中农业火学，2006．【8】赵海坤．猪圆环病毒2型分子流行病学调查及其抗体的间接ELISA检测方法的建立．【硕士论文】．扬州：扬州大学，2008．[9】李文沽，李文涛，严伟东，等．中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析【J】．畜牧兽医学报，2009．40(9)：1358-1362．[10】LiWL，WangXW'MaT，eta1．Geneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)swainsisolatedbetween2001and2009：genotypePCV2bpredominateinpostweaningmultisystemicwastingsyndromeoccurrencesinEasternChina[J]．VirusGenes，2010，40(2)：244·251．【ll】HesseR，KerfiganM，RowlandRRR．EvidenceforrecombinationbetweenPCV2aandPCV2binthefield．【J]VirusRes，2008，132(1—2)：201-207．20 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析摘要：选取来自我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的24份PCV2阳性病料，经处理后接种pK-15细胞，并进行传代。传代过程中用PCR技术对分离株进行鉴定，扩增PCV2特异性目的条带，证实获得了16株PCV2分离株。间接免疫荧光检测结果进一步证实了16株PCV2毒株在pK-15细胞中获得了增殖。通过对16株PCV2分离株进行全基因组序列扩增、克隆和测序，获得了16株PCV2分离株的全长基因组序列。对这16株PCV2分离毒株与24株代表性PCV2毒株进行ORF2基因同源性分析、系统进化树分析和氨基酸序列分析。ORF2基因同源性分析结果表明，16株PCV2分离毒株与GenBank中其他24株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于83．7％．100％之间，与华东地区21株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于88．0％．100％之间，16株PCV2毒株之间的ORF2基因同源性为88．o％．100％。基因型分析结果显示，2009．2011年华东地区PCV2毒株存在3个基因型，即PCV2a、PCV2b和PCV2d，PCV2d基因型相对PCV2a和PCV2b更为流行，但与地理位置无明显相关性；ORF2氨基酸序列分析结果表明，16株PCV2分离毒株与GenBank中其他24株已知参考毒株相比，ORF2编码的Cap蛋白存在3个变异度较高的主要区域53．91aa、121．151aa和190．215aa，且相关抗原表位区域存在变异。这些突变位点是否影响病毒的生物学特性，还有待于进一步研究。关键词：猪圆环病毒2型；分离鉴定；序列分析ABSTRACT：Twenty-fourPCV2-positivesamplesfrom7provinceswereinoculatedonpK-15cellstoisolateviruses．TheisolatedviruseswereidentifiedbyPCRandspecificfragmentwasdetectedin16isolates．Thereslutsofindirectimmunofluorescenceassay(IFA)furtherprovedthatthese16PCV2-positiveisolatesCanproliferateinpK-15．Thecompletegenomesofallisolateswereamplified，clonedintovector，sequencedandanalysed．ThewholegenomesofORF2geneof16isolateswerecomparedwim24PCV2referencestrainsregisteredinGenBanktoconstructphylogenetictree，homologyanalysis2l 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析andsequenceanalysisofaminoacids．1flleresultsofhomologyanalysisdemonstratedthatthehomologybetween40virusstrainswere83．7％to100％，thehomologybetween21virusstrainsinesternChinawere88．0％to100％，thehomologybetween16isolateswere88．0％to100％．ThephylogeneticanalysisindicatedthattherewerethreesubgenotypesoccuredinestemChinafrom2009to2011，PCV2a,PCV2bandPCV2d．ThePCV2dwasmolepopularinEasternChinathanPCV2aandPCV2b．ButthedistributionofPCV2didnotshowapparentgeographicalcharacteristics．AndtheaminoacidsequencealignmentofthecapsidproteinencodedbyORF2geneshowedChinesePCV2strainsexhibitedthreemajorregionsofgreaterheterogeneityatresidues53-91aa、121-151aaand190—215aaandsomemutationsintheepitopesresidues．However，thesemutationsaffectthebiologicalcharacteristicsoftheviresrequiresfurtherstudy．一l皿YWORDS：Porcinecircovimstype2，isolationandidentification，sequenceanalysisPCV2病毒粒子呈正二十面体对称结构，无囊膜。核酸和衣壳蛋白组成PCV2完整的病毒粒子。病毒基因核酸是一条共价结合形成的闭环单链DNA结构，分子量是O．58x104Da，长1767bp或1768bp；病毒衣壳蛋白为一条多肽链，分子量是3．6x104Da，病毒直径为17nm左右。有研究证明，PCV2分为两种主要基因型PCV2．1和PCV2．2即为PCV2b和PCV2a，并提出PCV2．1是引起PMWS的主要致病因素【卜31。PCV2是极小的动物病毒，主要引起PMWS，造成免疫抑制。PMWS可引起断奶后和育成期仔猪尤其是5．12周龄仔猪的进行性消瘦、皮肤苍白、黄疸、呼吸道症状、浅表腹股沟淋巴结肿大、腹泻和中枢神经障碍等临床症状，以及全身淋巴结炎症、肝炎、肠炎、肾炎和肺炎等病理变化，发病率为4—30％，病死率为50．90％，对养猪业危害极大。PMWS已经给世界各地养猪业造成了重大的经济损失【6】。我国自从2000年首次出现此病报道以来，经调研，许多省份都存在PCV2流行和感染的情况，感染程度全国各地不尽相同【4,5,7】。为了对华东地区PCV2的流行情况进行系统的分析，比较该地区PCV2毒株之间的差异，进而从分子生物学层面研究PCV2的诊断及免疫方法，我们从我国山东、安徽、 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的送检血液或组织样品中，选取24份PCV2阳性病料，分离得至lJl6株PCV2分离毒株，并通过对其进行全基因组序列扩增、克隆和测序，对这16株PCV2分离毒株与其他24株代表性PCV2毒株进行ORF2基因同源性分析、ORF2基因的系统进化树分析和ORF2氨基酸序列分析。1材料和方法1．1PcV2阳性样品PCV2阳性样品来自第二章用PCR方法，从我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的疑似PMWS血液和组织样品中检测获得的24份PCV2阳性样品。1．2细胞、血清和病毒无PCVl和PCV2污染的pK-15细胞、PCV2阳性血清、PCV2标准阳性毒株PCV2Haian(GenBank登录号：FJ712216)均由本实验室保存。1．3质粒和菌株pMDl8-T载体购自大连TaKaRa生物工程有限公司；大肠杆菌DH5Q购自北京全式金生物技术有限公司。1．4其他试剂FITC-羊抗猪一IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。DL2000Marker、rTaq聚合酶、蛋白酶K、dNTP、DNApurificationkit、AxyPrepTMplasmidminiprepkit均购自大连TaKaRa生物工程有限公司。1．2％琼脂糖凝胶：称取1．29琼脂糖溶于100mL1XTAE电泳缓冲液中，加热溶解。酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)：取饱和酚25mL、氯仿24mL和异戊醇lmL，充分混匀后，用适量TE(pH8．O)覆盖，棕色瓶中避光保存。氨苄青霉素(Amp)：用灭菌ddH20配成贮存浓度50mg／mL，0．22um滤膜过滤后， 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析小管分装后-20"12备用。1．5主要仪器5804R台式高速大容量冷冻离心机；TP600梯度升降温功能PCR仪；JS．680B凝胶成像系统；101．510．001迷你垂直电泳仪；JJW．1KVA单项净化交流稳压器；HM．1水平电泳槽：SW．CJ．1FD超净工作台；电热恒温水浴锅；BB15C02培养箱；SPX．250BSH．II生化培养箱；ZP．200振荡器；超纯水器；MDF．U32V(N)．70℃超低温冰箱；KK23v60TI．20℃低温冰箱；SIM—F140雪花状制冰机；IX51OLYMPUS倒置荧光显微镜。1．6主要溶液及培养基的配制1．6．1细胞培养相关溶液DMEM细胞基础培养液的配制：DMEM粉一袋(13．4曲溶于1000mL无菌双蒸水中，JJIINaHC032．2g，充分搅拌溶解后调pH值至7．2，O．22pm滤过除菌，4。C保存备用。细胞培养生长液的配制：在DMEM细胞基础培养液中加入FBS、青霉素和链霉素，使其终浓度分别为10％、100U／mL、100lag／mL，4。C保存备用。细胞培养维持液的配制：在DMEM细胞基础培养液中加入FBS、青霉素和链霉素，使其终浓度分别为2％、100U／mL、100lag／mL，4。C保存备用。0．01mol／LPBS溶液的配制：分别称取NaCl89，KCl0．29，NaEHP041,449，KH2P040．249，充分溶于1000mL92蒸水中，调pH值至7．4，121℃高压灭菌15min，4。C保存备用。细胞消化液的配N-称取胰酶O．259，EDTAO．029，充分溶于100mL灭菌PBS溶液中，0．22lam过滤除菌，．20℃保存备用。青、链霉素贮存液的配制：无菌双蒸水配制青、链霉素贮存液使其终浓度分别为：1000U／mL、10000lag／mL，．20。C保存备用。300mmol／L的D．氨基葡萄糖盐酸盐溶液的配制：称取D．氨基葡萄糖盐酸盐64．689，充分溶于1000mL双蒸水中，0．22um过滤除菌，．20℃保存备用。24 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析1．6．2LB培养基LB液体培养基：胰蛋白胨109，酵母浸出粉59，NaCllog，溶于950mL蒸馏水中，调pH值至7．0-7．2，定容至1000mL。高压灭菌后备用。LB固体培养基：将LB液体培养基，每100mL力11．59琼脂粉，高压灭菌后倒入平皿备用。。1．6．3其他细菌悬浮液：50mmol／L葡萄糖，25mmoULTfis．HClpH8．0，10mmol／LEDTApH8．0，灭菌，分装备用。细菌裂解液：0．2moFLNaOH，I％SDS。1．7pK-lS坌W胞培养pK-15细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的T75细胞培养瓶中培养，培养条件为37"C、5％C02培养箱。待细胞贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，再加入2mL0．05％的胰酶消化约5分钟，向培养瓶中加入6ml10％的DMEM培养基，温和吹打单层细胞，使细胞成为单个细胞，然后加10％的DMEM培养基至160ml，然后分瓶，置于37。C、5％C02培养箱中培养，用于后续试验。1．8PCV29fl性样品处理无菌采集病料组织用手术剪剪碎、研磨、制成匀浆后，加5倍体积的DMEM液稀释成乳悬液，放入无菌离心管中，反复冻融3次，4"C8000rpm离一心8min，取上清，置于．70。C保存备用。血液样品经4000rpm离-心8min后，取血清，置于．70。C保存备用。1．9阳性样品中PCV2的细胞分离增殖将处理好的PCV2阳性样品用0．22um微孔滤膜过滤除菌后，取lmL接种长至单层的pK-15细胞，37。C、5％C02培养箱中孵育1．5h，换含2％FBS的DMEM在37。C、5％C02培养箱中维持培养18h后，用300mmol／LD．氨基葡萄糖于相同条件下处理30min，PBS轻洗2次，换含2％FBS的DMEM继续在37。C、5％C02培养箱中维持培养72h，．20。C反 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析复冻融三次后收获病毒液，保存于．70"C备用。将用收获的病毒液作为接种液，按上述方法将病毒传至10代。1．10细胞分离毒株核酸的提取取反复冻融的pK-15细胞培养液400laL于干净的Eppendorf管中，加入400laL的组织消化液(100mmol／LNaCl，10mmol／LpH8．0Tris—HCl，25mmol／LEDTA，0．5％SDS)并混匀，然后加入蛋白酶K至终浓度为500pg／ml，置于56"C水浴3小时，用等体积的酚：氯仿：异丙醇(25：24-1)抽提2次，12000rpm离心10min，取上清，加两倍体积的无水乙醇沉淀，一20"C静置30min，12000rpm离心10min，去上清，加入75％的乙醇清洗沉淀，12000rpm离心10min，去上清，用50uLTE重悬沉淀，一20℃保存备用。1．11细胞分离毒株的PCR鉴定1．11．1引物根据GenBank中收录的PCVl(GenBank登录号：AF071879)和PCV2Haian株(GenBank登录号：FJ712216)序列，选取PCV2相对保守而不同于PCVl的序列，利用Oli906．0软件设计一对PCV2特异性引物，由上海英骏技术有限公司合成，引物序列如表3．1。表3．1PCV2特异性检测引物Table3-1PrimerssequencesfordetectionofPCV2F代表PCR正向引物；R代表PCR反向引物。F，forwardPCRprimer；R，reversePCRprimer．其中引物扩增片段大小为722bp，roTE缓冲液配成适当浓度100laM，贮存于-20 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析℃冰箱备用。1．11．2PCR鉴定取细胞分离毒株基因组DNA为模板，在PCR反应管中，按照以下体系进行扩增，总体积25llL，如表3．2。表3．2PCR扩增反应体系Table3-2PCRMixtureforamplificationofPCV2模板1此10xBufferSFORF2(20pmol／laL)SRORF2(20pmol／IrtL)dNTP(2．5mM)MgCl2rTaq酶ddH2016．259L反应程序：95。C预变性5min，1个循环；94。C变性30sec，56。C退火30sec，72。C延伸50s，共40个循环；最后72。C延伸10min。1．11．3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定采用常规琼脂糖凝胶电泳进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为1．2％，含溴化乙锭0．25ug／ml，缓冲液为0．5×TBE，以100V衡压电泳40分钟左右紫外灯下观察结果。1．12间接免疫荧光检测将正常的pK．15细胞接种于24孔细胞培养板中；将第10代细胞传代病毒液接种至长至90％的单层pK．15细胞上，同时设立阳性对照和阴性对照，37℃、C02培养箱中孵育lh，PBS洗涤两次后，换含2％FBS的DMEM维持液在37℃、C02培养箱中培养72h后，弃去培养液，PBS洗涤两次后，用多聚甲醛固定10min，经PBS洗涤后，每孔加入I％BSA，作用30min，经PBS洗涤后，再每孔加入200倍稀释的PCV2阳性血清，置37℃、C02培养箱中孵育1h，经PBS洗涤5次后，再加入50倍稀释的L。d驯驯瓤怔扯渤雄啡驰批脚 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析FITC-羊抗猪一IgG，置37。C、c02培养箱中孵育lh，经PBS洗涤5次，置倒置荧光显微镜下观察结果。1．13PL'=、／2细胞分离毒株全基因组PCR扩增1．13．1引物设计根据Gen．Bank中收录的PCVl(GenBank登录号：AF071879)和PCV2Haian株(GenBank登录号：FJ712216)序列，选取PCV2相对保守而不同于PCVl的序列，利用Oli906．0软件设计一对可扩增PCV2全长基因组的特异性引物，由上海英骏技术有限公司合成，引物序列如表3．3。表3．3PCV2全基因组扩增引物Table3-3PrimerssequencesforamplificationofthewholegenomeofPCV2F代表PCR正向引物；R4t表PCR反向引物。F’forwardPCRprimer；,R，reversePCRprimer．其中引物扩增片段大小为1772／1773bp，用TE缓冲液配成适当浓度100uM，贮存于．20℃冰箱备用。1．13．2全基因组PCR扩增取经鉴定为阳性的PCV2细胞分离毒株基因组DNA为模板，在PCR反应管中，按照以下体系进行扩增，总体积25uL，如表3．4。反应程序：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2rain，共40个循环；最后72℃延伸10min。28 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析表34PCR扩增反应体系Table3-4PCRMixtureforamplificationofPCV2模板1此10xBufferSFPCV2(20pmoVpL)SRPCV2(20pmol／}lL)db玎rP(2．5raM)MgCl2rTaq酶ddH201．13．3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定采用常规琼脂糖凝胶电泳进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为1．2％，含溴化乙锭O．25u咖l，缓冲液为0．5×TBE，以100V衡压电泳40分钟左右紫外灯下观察结果。1．14PCV2坌m胞分离毒株全基因组的克隆1．14．1PCR扩增产物的回收与纯化参照DNApurificationkit说明书回收扩增的目的片段。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的片段(1772bp／1773bp)的琼脂糖凝胶，放入Eppendorf管，按1：3的比例(凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数)加入ExtractionBuffer，放到50℃的恒温水浴锅中10min左右，期间2．3分钟混匀一次，直到凝胶融化。然后将混合液体转到回收柱内，6000rpm离心lmin，弃去接液管内的液体。向回收柱内加500“LExtractionBuffer，12500rpm离心30see，并弃去接液管内液体。再次于12000rpm离心lmin，然后将回收柱转移到一个干净的1．5mL离心管中。向回收柱内加501aL灭菌蒸馏水，于室温静置lmin，于12000rpm离心lmin。收集管内含有回收纯化的目的DNA片段，可直接做连接或放．20℃备用1．14．2PCR产物与pMDl8-T载体的连接L。正脚却驯却砒鲫苈．雄娜眦批脚铆(1l 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析参照pMDl8-T载体说明书将PCR产物与pMDl8一T载体连接。将PCR产物与pMDl8-T载体建立109L连接体系如表3．5，于4"C过夜。表3-5pMDl8-T载体连接体系Table3．5pMDl8-TVectorligationreactionsmixturePCR产物4．5pLpMDl8-T0．5pLSolutionI5“LpMDl8-T载体结构示意图3．1。捌瞻lI鞋劬l摹—娜1只时lI峨lIJI瞥l毒■l触V·一T．O耐ag鼬●捌■l蠢—啪la嘲l翮I硼l壹Il渊lj翰●IfirmⅡ囊-IAml囊■鲫l躺赳挈!罹}赳螋。型!闺墅!。熘1．14．3制备感受态菌：=：茹粼7，燃：嗍刚图3-1pMDl8-T载体限制性图谱Fig．3—1RestrictionmapofpMDl8-TVector将大肠杆菌DH5Q在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16．20小时。从平板中挑取一个2-3mm大小的单菌落，在无菌条件下移至含有2mLLB液体培养基的试管中，37"C300rpm剧烈振荡培养5-6h，无菌转接到含有50mLLB液体培养基的250ml三角瓶中，37"C300rpm剧烈振荡继续培养约3—4h，使细菌的OD600达到0．4左右，肉眼见浑浊。在无菌条件下将细菌培养液转移到一个无菌的，用冰预冷的50mL聚丙烯离30 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析心管中，冰浴30min，于4。C4000rpm离心10min。回收细胞弃上清，将离心管倒置在吸水纸上1min，使残留培养液流尽，加10mL预冷的O．1mol／LCaCl2重悬沉淀，置冰浴30min后于4。C4000rpm离心10min，回收细胞弃上清，将离心管倒置在吸水纸上lmin，使残留培养液流尽，沉淀中加2mL冰预冷的O．1mol／LCaCl2，悬浮细菌。如长期保存，则需加入终浓度为10％的无菌甘油，小管分装，一700C冻存。1．14．4转化取100I．tL感受态菌液于无菌1．5mLEppendorf管中，加入连接产物109L混匀，冰浴30min，将离心管放到42℃水浴中加热45s，快速将离心管转移到冰浴静置lmin，加入5009LLB液体培养基，然后将离心管放到37。C震荡培养60min，取2009L转化菌液涂含有Amp的LB固体培养基(含50lag／mlAmp)，室温放置20一30分钟，待溶液被琼脂吸收后，将平皿倒置于370C培养箱中过夜，可出现白色单菌落。1．14．5小量提取质粒DNA参照AxyPrepTMplasmidminiprepkit说明书小量提取质粒DNA。挑取新鲜的白色单菌落，接种到4ml的LB液体培养基中(含50ug／mlAmp)，放于37。C300rpm的恒温摇床中震荡培养过夜。室温下取1．5ml菌液加入到1．5mLEppendorf管中，10000rpm离心lmin，弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。加入250gL已加入RNaseA的BufferA1，用移液器充分悬浮细菌细胞。加入250儿BufferB1，轻轻地反转5．10次以混合均匀，然后静置2．5分钟至溶液粘稠而澄清。加入350儿BufferNl，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。室温下13000rpm离心10分钟。小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀)，室温下13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。向DNA柱中加入500儿BufferKB，室温下13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。向离心柱中加入650gLDNAWashBuffer(含终浓度为80％的无水乙醇)，室温下，13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复一次，向离心柱中加入650I．tLDNAWashBuffe(含终浓度为80％的无水乙醇)，室温下，13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析开盖离心2分钟，以彻底去除残留的乙醇。将离心柱转至一个新的1．5mL离心管中，向DNA柱的正中间加入80儿ddn20(pH在7．5)，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱质粒DNA。将洗脱液再加入到柱中，在13000rpm离心1分钟，收集洗脱液。1．14．6质粒酶切鉴定1．14．6．1质粒酶切将已插入目的基因的质粒，通过SacII酶切的方法判断阳性克隆。酶切体系(109L)如表3-6。。表3-6酶切体系Table3．6Thesystemforrestrietionenzymedigestion质粒29L0．51xLl}IL6．51xL将反应体系充分混匀，在37℃水浴中反应3．0小时。然后放入70℃水浴灭活15min终止反应。1．14．6．2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定采用常规琼脂糖凝胶电泳进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为1．2％，含溴化乙锭0．251xg／ml，缓冲液为0．5xTBE，以100V衡压电泳40分钟左右紫外灯下观察结果。1．15PCV2细胞分离毒株全基因组的测序将质粒酶切鉴定为阳性的PCV2细胞分离毒株，送到上海英骏技术有限公司，运用双向测序的方法测序，获得的序列再利用序列拼接软件DNAStar软件的SeqMan进行拼接，得到16株PCV2细菌分离毒株的全长基因组序列。32hni重如龇m沁 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析1．16PCV2细胞分离毒株ORF2基因同源性分析、遗传进化树分析和氨基酸序列分析将这16株PCV2分离毒株与24株代表性PCV2毒株进行ORF2基因同源性分析和ORF2氨基酸序列分析，并利用DNAStar软件绘制出系统发育树，进行ORF2遗传进化树分析，从而找出华东地区PCV2不同流行毒株之间，以及华东地区PCV2流行株与其它国家毒株之间的进化关系。引用参考毒株见表3．7。表3．7引用代表性PCV2毒株一览表Table3．7DetailsofPCV2strainsdownloadedfromGenBankdatabase 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析2结果2．1细胞分离毒株的PCR鉴定将处理后的PCV2阳性样品接种pK-15细胞，连续传代至第lO代，在传代过程中，用PCR方法扩增PCV2特异性基因片段，逐代鉴定PCV2病毒是否在pK-15细胞上的获得增殖。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外观察可见阳性结果显示出大小为722bp的特异性条带，与预期相符，见图3．2。分离毒株的PCR鉴定结果证实，从24份PCV2阳性样品中得至lJl6株PCV2细胞分离毒株，分别命名为200904JS、200906JX、200909SD、200910SH，201103FJ，201003JS、201108ZJ，201107AH，201102JS，200911ZJ，201004AH、201005FJ、201006JS、201006SH、201010SD、201102AH。bpM12345678920001000750500250100．．--722bp图3．2部分传代毒株的PCR检测结果Fig．3-2ElectrophoretogramofthePCRproductsamplifiedfromthePCV2isolatesM：DL2000Marker；1．7：部分细胞毒样品；8：阳性对照：9：阴性对照M：MarkerDL2000Marker：1-7：partialisolates；8：Positivecontrol：9：Negativecontrol 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析2．2间接免疫荧光检测24个分离毒株以及本实验室的PCV2阳性毒株PCV2Haian株感染pK-15细胞72h后，用间接免疫荧光试验检测病毒是否存在，PCV2PCR检测阳性的16个分离株以及PCV2Haian／t朱在倒置荧光显微镜下，可在细胞核和细胞浆内出现特异性绿色荧光；而PCV2PCR检测阴性的分离株和阴性对照细胞中未见荧光，见图3．3。间接免疫荧光检测结果进一步证实，从24份PCV2阳性样品中得到16株PCV2细胞分离毒株，与PCR鉴定结果一致。PCV2-PCR阳性分离株阳性对照阴性对照PCV2-PCR阴性分离株图3．3间接免疫荧光检测分离毒株感染pX-15细胞结果Fig．3-3DetectionofthepK-15callinfectedwithPCV2isolatesbyindirectimmtmofluorescenco2．3PCV2细胞分离毒株全基因组PCR扩增以鉴定结果为阳性的16株PCV2细胞分离毒株基因组DNA为模板，利用PCR方法进行全基因组序列扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果表明，16株PCV2细胞分离毒株都出现了与预期大小相符的目的条带，约1772／1773bp，图3．4给出部分样品扩增结果。 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析2000l咖7505∞2501∞M12345．．卜1772／1773bp图3_4PCV2全基因组的PCR扩增结果电泳检测Fig．34ElectrophoretogramofPCRproductsofPCV2completegenomesequenceofpartialsamplesM：DL2000Marker；1-3：部分PCV2细胞分离毒株；4：阳性对照；5：阴性对照M：DL2000Marker；1-3：PCV2isolates；4：Positivecontrol：5：Negativecontlol2．4质粒酶切鉴定结果将全基因组扩增产物与pMD-18T载体连接后，用限制内切酶SacII酶切进行酶切鉴定，电泳后可见1772／1773bp预期大小的DNA片段，图3．5给出部分质粒酶切鉴定结果。bpM1234200010007505002501∞．．卜一1772／1773bp图3．5质粒酶切鉴定Fig．3-5IdentificationoftherecombinantplasmidsM：DL2000Marker；l_4：重组质粒限制内切酶SaclI的酶切产物M：DL2000Marker：1-4：ProductsofmcombinantplazmiddigestedwiththerestrictionenzymeSaclI 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析2．5PCV2分离株的全基因组测序结果将质粒酶切鉴定为PCV2阳性的细胞分离毒株，双向测序、拼接，得到16株PCV2细菌分离毒株的全长基因组序列。其中，有3株201108ZJ、201102AH、200910SH全基因组为1768bp，其他13株全基因组为1767bp。见表3-8。表3．8PCV2分离株全基因组测序结果Table3-8completegenomicmucleotidesequencesofPCV2isolates2．6PCV2分离株与参考毒株的ORF2基因同源性分析应用DNAStar软件对获得的16株PCV2分离株的ORF2基因序列以及GenBank中的其他24株已知参考毒株的ORF2基因序列进行同源性分析。结果表明，16株PCV2 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析分离毒株与(}enBank中的其他24株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于83．7％-100％之间，与华东地区21株已知参考毒株的0R22基因同源性介于88．O％．100％之间，16株PCV2分离毒株之间的ORF2基因同源性为88．0％．100％，见图3-6。耋霎耋菱萎萋茎萋萎霎嚣善骞蚤导姜薹蓦毒蒉子耋嚣詈妻§霎耋蓁霎耋霎薹耋霎詈萋菱萎蠢霉窝努羁嚣眷舞蓦嚣窝醵骚蚕鞭鞭嚣嚣嚣雏薹藿摹螽螽螽焉瞢胥罄囊嚣嚣焉磊_r一^^一^～’一Ⅳ⋯一_^一-～’～^●辜=簧墓譬擘粤舞罱甜禽葛祷啊岛曩内霉葛辩再葛擒冀禽■再霉穹∞警譬吝舀墓鑫裔盆器舀器每备n是申警^舀h容h象舀墨誊麓是q^-蔷a象-'警誉器晷l●一霉点舞譬蔓i吾囊_一——若毋峦i舅搿掰i客奄萎墨嚣荟燕豢曼2麓蠢刍善-譬嚣卜警毒菪毫晷盆誊一复a罐萎荟’=啦誊窭＆客若≮=：=番l^。●———。‘=一釜&一釜各碰奎盔≈曩《叠葛●盘蕊萎警皇重薯銎_盏墨_～一-_一警_萎釜_一-：叠蠹兽曩蓉叠曩蠢聋摇瑾曩盛蓝叠曩备吾一蓉暑-^一-_一卜．-萎警一巾萎一暑舀一客蓉一采磊{一窘搿瓮甚曩露基爱釜盛疆爱矗曩爱瑶盘盛叠爱盘曩矗8罐嚣窨苫n臻●暑蔷主警一_a。pa_。宝鑫-●晷‘，。C，a宝。一C，．．舀髫客_'ao_一嚣曩番罐墨矗g矗囊薯曩蔫矗窖矗a●盏窜镬露曩蛊8客瓣§荟，-n誊h盆誊_警b；t’盏一客aP畸晷荟-蓍-卜芝警∞‘’蓉l≥蔷一苫2m豫；罐，_一一__—_一薯罐甓譬盘吾蕊曼一蔷啦竹一c，d2d葛—n_—‘-—-，霜瑶盘曼='t薹葛aq暑荟t暑窖8警霉皇搿：罱r-蜀露8q一q一。警_曼蔫苫。曼墨⋯i“；t萎竹暑■点蔓疆．蔓童矗曼●i西卜奎卜鑫＆舀＆瞄釜锰箸备墨舀鑫量蓝蛊岛盆矗叠曩麓蔷舀譬葛_善蓉客暑_二_。孽g曩葛釜墨。§矗搿q奎一薹§●h童h是&奎h舀柙釜-蓉奄舀复一h舀蚤嚣象嚣卜．■一竹卜州0辑番≈爱搿譬爱舞sl碰爱，-_一C，e，一蓉警-，pa耄蔫a意t，蔷一譬一_熹窘3未暑一昌善客蕞孽罐苫g套蔫爱蛊疆葛荟葛蕞蕊舞穗霜j荔囊冀歪舀_=t叶n．-卜P套一n氧妇蕊一Pp毫一_．_釜^-i；l_}■：：：；“n：l善霉‘‘田∞u-a{罟●2tj一霸∞’’_-●一墅主l：ac，P■；譬毒望盘曩爱搿嚣曼8g霹鲁g爱叠爱誉一譬釜≈一—●”=====；二五：一n=：==：=i一荟接露盘舟＆叠客≤矗g象瑶譬罐曩窭矗盘警叠誊备嚣琏堕冀i暑墨_一若釜霉嚣鑫。帅萎霉缸暑嚣一心嚣誉盘矗备矗锰矗霜霉番％一。一蓉∞釜*一∞蓉h一h誉耋∞’釜∞曲暑j_一☆．暑矗客锰蓉晷爱毒童罐曩矗疆缓毪墨g曩基d卜是尝裔=号卜≈氛一冀摹釜h熹一蕃晷●菪‘z量爱●，稳蔷蝣。a晷荟籀晷釜_暑：暑嚣暑cid爱捣曩露荟墨窖霹嚣程囊。量誊崎晏．-一萎a一萎暑羹萎’=莹崎a凸荟塞■●‘墨2鑫●2釜0h02望蛊掩“i_HH●i——●——*HHH静曼2黑●j一2等2总0焉——__一__．烹●-H‘●-^童菩宴赛嚣未篚荟i“=是暑●，譬0=2h穗羞葛百i1i曼q●i善W■重萎i苫g葛窨曼i--矗q璺露盘一鬲i暑墓量萎善暑疆葛=量誉璺薹萎●，垂=。=量害蔫譬盛曼i一-萤c■’●矗q宝曼荟誊璺嚣盆g夏●矗o；C，荟-婚一未蔷白釜暑薹暑蔷嚣蓉磊未i■器嚣苫’-罟譬盏P菩警≈科善意五窖囊0囊譬 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析2．7PCV2分离株与参考毒株的ORF2系统进化树分析利用MEGA4．1序列分析软件，采用Neighbor-Joining方法Bootstrap等于100，对获得的16株PCV2分离株序列与GcnBank中其他24株已知参考毒株绘制基因进化树，如图3．7，进行系统进化树分析。从图中可以看出，2009．2011年华东地区PCV2毒株存在3个基因型，即PCV2a(3株)、PCV2b(4株)和PCV2d(9株)，PCV2d基因型相对PCV2a和PCV2b更为流行，但与地理位置无明显相关性，见表3-9。霉x，———-1———————·—————1—————————_———-1———__—-—-————_r—-——————————，8642O,AminoA甜d8油蛙h枣O疗搴秘l目秭嚣W∞籀酾舛潮01．pfo湖6嘲∞锄2781'．1。peo2∞鼙n轴93l湘嘲粕牛啦pro2∞50u2I嘲FJ愀5，2pm2啪HM776445辨'．pro2004^獭1542劓W们辫O弧略F壕ll键3S踟6、pro撇I∞104422)《sc舯2∞8ou241091E101珊02啪笳惦FJ87幽JTS∞静lb．p帕2∞引l劲舯●201嗽FJ．pro●2∞9嘲77科朝8D．甜口2嘲lGU2鲥I鞠FJN柏412．p102006EF210t值孙幽幛20∞事糟2雠引j鞠776446,*2pI'o2006EF52柏筠鼻翻孵，砌2001t∞3鞠辩8}m7柏．p∞瑚∞6孰p怕童201003,18。pTo●^F酶5∞●pc嫩翻奇2∞S”“辐稻甜帕5|甜O^FD55392咒楣‰I幢2∞4∞1锻．19JsC舯201102^H摩摊★201t08zl》哺★2咖钔O钢pro,∞∞雠嚣p∞★湖哟∞80．peoe20l懈,18簿O★为10髓SH；p船★20j010SD。嘲■201102胡堇_掣尊★2甜103FJ．pro●201101^H。p∞★20晒嘲O湖∞^R删2∞8嘲716453Z鼻3e，翻_o20∞嘲7，¨3≯皓≯#m201004^H翻婚☆E们硒∞3P岱，2C呷●图3．7PCV2ORF2系统进化树分析PCV2bPCV2aPCV2dPCV2cFig．3-7PhylogenetictreeofPCV2isolatesbasedonORF2genomesequence39 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析2．8PCV2分离株与参考毒株的ORF2氨基酸序列分析16株分离株与24株参考毒株的ORF2氨基酸序列比对分析结果表明，虽然基因突变位点分布在衣壳蛋白的不同位置，但存在3个变异度较高的主要区域53．91aa、121．151aa和190．215aa，图3．8。 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析lO20S040SO‘0'OeO量0i00iiOi30^r翟曙i霹H：咒^·p∞of弘1矗口町托臀H爵日曙翻再口u捌髓目吨w坤Nqq—峨啊啊豇玎Ⅱ目·羽日％EN霸也叠暖曩葛同错口●■n江d挂V期搀皇克娜口：孽E幻童珥孵再w翻P漤nQ暖翻，晦5i202琳日∞铺”‘渤，O工．婶⋯L⋯．X⋯⋯⋯．．■JI．．L⋯一S．‰’m：∞7辱口渤9；窖SHO，40．pro’⋯Z⋯．．葛⋯⋯⋯．．再．N．．L⋯．．S．P囊．’120，^陆i以々n●'tt^●^．'h’霄^，Ttt■tt_=■，'^艄疆坼，拄030^E．pro’．．基⋯窘⋯．肆⋯⋯翳．H，．L⋯¨S．pZoo：：O：*童鲫￡-145∞【．i．p‘o1oV"1l摊．=：20：0镩聊9446∞卜：．p拍’⋯工⋯．．t⋯⋯⋯．．H．H．．L⋯．．茎．PR．’i：03辫t量田甜SlZJ·"．prot’⋯￡⋯童⋯．冀⋯⋯冀．肆一L⋯．．5．，ia’：钝'叠f7，t”，”-3．pro’rr．．叠．⋯祷⋯．．．冀．肄．．L⋯．．S．PZax：oc'职?薯450SD．∞Tr口"■，t∞'，i：O加洲蔼．；r0o．矗⋯R⋯．譬⋯⋯冀。辩¨L⋯．．S．扰．群：2：2∞，eS矗．∞’⋯!⋯．．最⋯⋯⋯．．尊．N．．L⋯．．S．强oj202*螂∞．wo-K．．．忘⋯．肆⋯⋯岔．冀．．L⋯．．S．PZ．F120：∞，∞稿．#oo’3．S．辩．zZ0：蝴li茹．mt6．H．冀．．L⋯．-S．摊．’{：0：Oi辎矗．w{’⋯I⋯．．t⋯⋯⋯．．N．H．．L⋯．，S．豫．⋯l：0：010驰勰．pro-r，囊女．冀．蟑．．L⋯．．S．P：．0、j：e：0土30SW．p．-o⋯I⋯．．t⋯⋯⋯．．譬．■．．L⋯．．S．豫．’．：：0：，1辩E品．站o’roR．⋯冀⋯⋯冀．基．．L．．．．．5．PZ．To：at，0t臻．；‘o。’麓⋯R⋯．肄．⋯．．葛．贯一L⋯．．5．P￡嚣i2：0014j矗SD．pro’．t．．．衰⋯．冀⋯⋯辟．嚣．．L⋯．．3．窟∞i2。：0jie：艋．叠roti0．．甜玉i2。2口l：∞潞．Wo’K⋯篡⋯．冀⋯⋯茸．辩．．L⋯．．3．Pl江⋯i2020j土03"．口o7’L．．曩⋯．并⋯．．．N．11．．L．⋯．S．蜀0矗：2020l抽1越．舛ot‘o．．童⋯．B⋯⋯薯．拜．．L⋯．．S．PI量工Z000lt解苗．站。乙5i．L．．*⋯t120触曙S53§{￡CV：b。pr口．．’H．N．．L⋯一S．≥氍．：：20E乳‘凸0，霉e72】：．pro⋯．。^⋯．：．V⋯臻嫩．诤⋯．⋯⋯冀．穗0．L⋯一s．Pzd'也‘iZ02∞{二髓}：St：范0tel．pzo’N．靖．．L⋯．．s．豫．o：20，M●MⅢ¨‰t^12∞‘De：0{t：：Xsc．■￡o⋯I⋯．．X⋯⋯⋯．．靖．N，．L．．．．．5．讯．’i202∞t嚣：33S§’嬲翻0412．p=e’⋯I⋯．．X⋯⋯．．：．．爵．辩．．L．⋯．S．#R．．’：202嚣5z诫{{5S‘勰0S．口￡c．，．I．⋯．X⋯⋯⋯．．S．H．．L．⋯⋯．5．’i：02∞j?：￡{{Se3S005．pzo．．．’’．N．H．．L．⋯．S．m．：；2eZ005暂：{，}；：F∞05：：．≯zo⋯．Ⅺ’N．H．．L⋯．．S．罪．。：20：*是乳拿姆3i盈LE缸ho‘1．OS．事∞⋯．⋯Z⋯．．￡⋯．．．．．．．．*．H．．L．⋯．S．m．：=20：∞{￡罩：i0：0￡0ntJi●∞：006．pz一：⋯．Z⋯．．Z⋯⋯．⋯．暑．H．．L⋯．．S．豫．tj：O：诣i￡f'：‘S，5疆060：．proL：，fw．冀．．L⋯．．S．捧．tj20：00iS睨l，99lr蕊060：．pto⋯．Z’w．对¨L⋯．．5．张．1t：0，M‘■㈣⋯口⋯TrwHT≈曲’iSei{0155：E0：：0二{0j强：O-32ie22C,：30孟＆Ss3{：蹦^．；：o珏Z口￡珏疆V=j昼：越：曩霉r谢Y5矗饿：：P嗣落薯驾硝霉五基孙巴搿汀墨野E_=鬈话昂圆嚣量噶；g鞋舔m靖尚山∞五班强韪谨凇强￡弱若g嬲矗gf磁z礅辫233：00，a：3S3；§{JSC'TC：I．prof±，'fn，t}：∞’；03Se99}$g。740．}【oS’一’『⋯⋯⋯．⋯⋯&．：33：∞eFJ％70％7SSD：c-!b．}roS⋯’々’r＆．033：*iE*e{30辩地．}z口Ⅱ'’'暴．K：：{：0拈鄹，#q{5强一i．pr，Z置．．：^’tf．⋯*．：S3：。ej置驴：‘{{e嚣·2．p‘o"，i≈：000毪孵，‘{53ZJ一38．pro．．．．．．，．．．．，．譬．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．r⋯．，⋯．T⋯一：⋯⋯．，：⋯⋯⋯⋯⋯．R．K：l{：∞’尉’一E{S7rJ一3．pre．．．．．．．．．．．，．H．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．，R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．r⋯．．．．．．：．．⋯：⋯．．．．．．⋯⋯．．．⋯．⋯X．g：34：∞，塞”${S05D．》ro}’十tf冀．二33：00，“∞．m口f口，T■，t’：00事*3"X．pro'’!．．．E#．230：％'∞∞．W；Ef最．：33：*÷二0g．p：o：口∞“2J．W：k’r⋯．R．：；3：0ioe3品．pro氟．．’r’I⋯t缱，：j3201004超．X0⋯⋯⋯⋯．K⋯．．⋯⋯⋯．．1：0j∞5对．#o{'20100￡器．群o⋯．⋯⋯⋯g⋯⋯⋯⋯⋯．t．．．．．．．．．．⋯．．．；t．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．}⋯⋯⋯：⋯．．I⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．H．：S32艇0％g．“o⋯⋯．．⋯．．H⋯⋯⋯⋯⋯．1．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．}⋯．．⋯．：⋯．．：⋯⋯，．1⋯⋯⋯，⋯⋯X．二SS：3i锃0嚣．}zc．⋯．．⋯．．．，&⋯⋯⋯⋯⋯．1．．．．．．，．．．．．．．．．R．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．}．⋯⋯，．：⋯．．：⋯⋯，．⋯⋯．．．⋯．．．．H，：332。i二0Z越．Wc≈咒tv’P’：{t：0ji02潞，耳c．．．．．⋯⋯．．g⋯，．．．．．．．．．．．．t．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．，，．．．．，．．．．．}．．．．．．．．．f．．．．．I⋯．．．．．．．．．⋯．．，．．．⋯．H，：3320{二∞-”．p￡oH'R⋯⋯．．‘●Ⅵ．2S3：0i二0：≈．#e．i⋯．⋯．⋯．⋯：#t’”；t’：0j：0e*。；：c；．砰．S233AFe5539i兰}∞仕．}：0：，”．2j3[UZ4S503戡：c．9：{Ⅱ’q“‘‰A．．V．”．爵234：，0t■￥∈l：S{：范0t(：：．p：otR．．Tt’o．H．Z33i004∞104419嚣C．；zo}．，S．：33Z0：{D乱0{{：ZXjC．pc÷§，，：00{∞：3∞0{E锶Pe4i2．pro}’"．：33200j}Je{{S耗A}105．}：ci⋯．．⋯．!’Z⋯=⋯．"．233200S=了￡{{5￡3S0：S．pz々}，t；’t’．．．"．233：005；嚣{’}}=}：§H}CS：：．p：o}’：+’oB．233Z305[z-I站”iHangzhou一二5．pro；，r：0÷feF：：0i0￡：be；二ek0：00E．≯毒．．．．．⋯．．．．。．．．．．．．．⋯．，⋯：≈．．．．．．．．￡．．．．．．．一E．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯#．Z53二：XEL，$2453S0X050：．p：：s．，．7：’。t．M．2，3：0C￡；莨{1；}二}：导：Cd0二．}r0：々f：’}％_j、=0C‘西钟3$0：7SS．#zo々eeo：za：二o=’0eo，za31c=}‘‘：H：趣{a5’．’}：eg二0tes：ba：黜：oh盖}0Sj3；二PCV2a，；：；eKacclY图3。8PCV2ORF2基因氨基酸序列比较Fig．3—8DifferenceanalysisofORF2aminoacidsequenceofPCV241 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析3讨论PCV2为单链、闭合环状、无包膜的DNA病毒，通过PCV2全基因组序列研究将该病毒可分为两种基因型PCV2a和PCV2b[31，且PCV2b和严重的圆环病毒相关疾病的发生和世界范围内PCV2基因型的变化有关，PCV2a和PCV2b两种基因型的全基因组大小分别为1768bp和1767bp，同源性近似为95％。有学者认为存在PCV2a、PCV2b和第三种基因型PCV2c，特别是中国大部分地区主要以PCV2b基因型为主，但是，不属于PCV2a和PCV2b的基因型是否都属于PCV2c，有待证樊¨】；又有研究表明PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e五种基因型，我国存在PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2e四种基因型，且国内的流行基因型是PCV2b[12,13】。为了进一步了解华东地区PCV2的基因型流行特性、遗传进化和地方株特性，本研究对2009．2011年采集自华东地区的PCV2阳性病料进行细胞分离，PCR和免疫荧光检测结果表明，本研究成功分离到16株PCV2毒株。其中，有3株201108ZJ、201102AH、200910SH全基因组为1768bp，属于PCV2a亚群，其他13株分离株属于PCV2b和PCV2d亚群，全基因组为1767bp，在1042bp处缺失了一个碱基。40株PCV2毒株的ORF2基因同源性介于83．7％．100．O％之间，可分为4个基因型，即PCV2a、PcV2b、PCV2c和PCV2d。本文中分离的16株PCV2毒株与华东地区2l株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于88．O％．100％之间，本文中分离的16株PCV2毒株之间的ORF2基因同源性为88．O％．100．0％，华东地区PCV2毒株可分为3个基因型，即PCV2a、PCV2b和PCV2d。国外有研究认为，PCV2的遗传变异与地域分布有关，但也有学者认为PCV2遗传变异与地域分布无相关性。本研究中所分离的16株PCV2毒株之间存在一定的差异，PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型在华东地区广泛存在，PCV2d基因型相对PCV2a和PCV2b更为流行，但与地理位置无明显的相关性。PCV2基因组包含11个开放阅读框，其中有2个主要的阅读框，即ORFl和ORF2。ORFl编码与复制相关的Rep蛋白，变异很小。ORF2编码病毒的主要结构蛋白Cap蛋白，与抗原性相关，变异很大。为了进一步研究由ORF2编码的衣壳蛋白(capsidprotein)的变异情况，对ORF2的氨基酸序列进行了同源性比对分析，结果表明ORF242 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析编码的氨基酸存在3个高变区，分别是53．91aa、121．151aa和190-215aa。众多研究表明，PCV2ORF2存在很多潜在的表位，69．83aa、117．131aa、132．146aa、156．162aa、175．192aa、195．202aa和230．233aa，这些表位在免疫压力之下，可能会发生突变，影响蛋白抗原性、病毒致病性和毒力的改变【8～。由氨基酸序列分析可知，16株PCV2分离毒株在表位69．83aa、117．131aa、132．146aa、175．192aa、195．202aa和230—233aa都存在变异，而表位156．162aa相对保守，这些突变位点是否影响PCV2生物学特性等还有待进一步深入研究。有研究表明Cap蛋白中P110—A110和R191--'-S191这两个位点的变异会提高PCV2在体外培养中的增殖效率，致弱PCV2毒株，降低其致病力【101。本研究中201108ZJ和201102AH在191位点都存在变异，与R191一S191不同的是，本研究中出现的变异位点是R191一K191，这样的突变是否有致弱作用，尚不清楚。本文通过对华东地区PCV2毒株的分离和基因型分析，明确了该地区PCV2存在基因多样性，进化不存在明显的地域相关性，丰富了华东地区PCV2感染的分子流行病学资料，为诊断PCV2感染及研究PMWS发病机制奠定了理论基础。43 华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查与遗传变异分析参考文献【1】GrauRomaL，CrisciE，SibilaM，eta1．Aproposalonporcinecircovimstype2(PCV2)genotypedefinitionandmeirrelationwithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)occurrence[J]．VetMicrobiol，2008，128(1-2)：23—35．[2】CheungAK,LagerKM，KohutyukOI，eta1．Detectionoftwoporcinecircovirusty砖2genotypicgroupsinUnitedStatesswineherds[J]．ArchVirol，2007，152(5)：1035-1044．【3】HorlenKP，SchneiderP，AndersonJ，eta1．Aclusteroffarmsexperiencingsevereporcinecircovirusassociateddisease：clinicalfeaturesandassociationwiththePCV2bgenotype[J]．JSwineHealthProd，2007，l5(5)：270—278．[4】郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J】．中国兽医科技，2000，30(3)：3-5．[5】郎洪武，王力，张广川，等．猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰竭综合征的诊断【J】．中国兽医科技，2001，31(3)：3-5．【6】6HesseR，KerriganM，RowlandRRR．EvidenceforrecombinationbetweenPCV2aandPCV2binthefield[J]．VirusRes，2008，132(1-2)：201-207．【7】LiWL，WangXW，MaT，eta1．Geneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)strainsisolatedbetween2001and2009：genotypePCV2bpredominateinpostweaningmultisystemicwastingsyndromeocculTcncesineasternChina【J】．VirusGenes，2010，40：244—251．【8】TruongC，MaheD，BlanchardP，eta1．IdentificationofanimmunorelevantORF2epitopefromporcinecircovirustype2asaserologicalmarkerforexperimentalandnaturalinfection【J】．ArchVirol，2001，146(6)：1197-1211．[9】MaheD，BlanchardP’TruongC，eta1．DifferentialrecognitionofORF2proteinfromtype1andtype2porcinecircovirusesandidentificationofimmunorelevantepitopes[J】．JGenVirol，2000，81(7)：1815—1824．【10】FenauxM，OpriessnigT'HalburP13leta1．Twoaminoacidmutationsinthecapsidproteinoftype2porcinecircovirus(PCV2)enhancedPCV2replicationinvitroandattenuatedthevirusinvivo[J】．J 第三章华东地区PCV2的遗传进化分析V'lrol，2004，78(24)：13440-13446．【1l】李文洁，李文涛，严伟东，等．中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析【J】．畜牧兽医学报，2009，40(9)：1358—1362．【12】Scgfl吉sJ，Olvcra八Grau-RomaL，eta1．PCV-2gcnotypcdefinitionandnomenclature[J】．VetRec，2008，162(26)：867-868．【13】WangF，GuoX，GeX，eta1．GeneticvariationanalysisofChineses廿amsofporcineckcovirustype2【J】．virusRes，2009，145(1)：151—156．45 全文总结1．应用PCR方法，对2009．2011年采集自山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的426份疑似PMWS猪血液和组织样品进行检测。实验结果表明，华东地区426份病料中，有230份为PCV2阳性，阳性率为54．0％。7省市送检的样品均能检测出PCV2阳性样品，其中浙江阳性率最高为59．5％，福建阳性率最低为48．O％。表明华东地区猪群中普遍存在PCV2感染，且感染率较高。2．从来自我国山东、安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建7省市的24份PCV2阳性病料中分离得至lJl6株PCV2细胞分离毒株，通过PCV2全长基因组扩增、克隆和测序获得了16株PCV2全长基因组，并对这16株PCV2毒株与24株世界代表性PCV2毒株进行了ORF2基因同源性分析、系统进化树分析和氨基酸序列分析。ORF2基因同源性分析结果表明，16株PCV2分离毒株与GenBank中其他24株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于83．7％．100％之间，与华东地区21株已知参考毒株的ORF2基因同源性介于88．0％．100％之间，16株PCV2毒株之间的ORF2基因同源性为88．0％．100％。基因型分析结果显示，2009-2011年华东地区PCV2毒株存在3个基因型，即PCV2a、PCV2b和PCV2d，PCV2d基因型相对PCV2a和PCV2b更为流行，但与地理位置无明显相关性：ORF2氨基酸序列分析结果表明，16株PCV2分离毒株与GenBank中其他24株已知参考毒株相比，ORF2编码的Cap蛋白存在3个变异度较高的主要区域53．91aa、121—151aa和190．215aa，且相关抗原表位区域存在变异。这些突变位点是否影响病毒的生物学特性，还有待于进一步研究。3．本研究通过对2009．2011年间采集自华东地区疑似PMWS猪血液或组织样本进行PCR检测，掌握了华东地区的PCV2流行情况；通过对华东地区PCV2毒株的分离和基因型分析，明确了该地区PCV2存在基因多样性，进化不存在明显的地域相关性，丰富了华东地区PCV2感染的分子流行病学资料，为疫苗株的筛选提供科学依据，为有效防控猪圆环病毒病奠定了理论基础。47 一!!l一．!!一致谢本文是在杨倩教授和何孔旺研究员的悉心指导和深切关怀下完成的。先生们敏锐的思维、严谨的学风、开阔的眼界、博大的胸怀使我受益终身。在此学生向您表示最诚挚的敬意和最衷心的感谢!论文完成期间，江苏省农业科学院兽医研究所王小敏在实验中给予我极大的帮助和鼓舞!江苏省农业科学院兽医研究所的工作人员温立斌、郭容利、俞正玉、茅爱华、王芳、倪艳秀、张雪寒、李彬、吕立新、周俊明、祝昊丹、沈江萍、周萍、李善军、朱轶和刘浩飞、李丽、汪伟、叶青、文世富等同学以及南京农业大学组织胚胎学组的各位老师、同学在实验上给予我很大的帮助与支持，在此一并表示衷心的感谢!特别向辛勤抚育我成长，不懈支持和鼓励我奋进的父母及亲人们表示深深的感谢!向多年来在工作、学习和生活上给予我无私帮助的所有的同事、同学、朋友致以衷心的感谢149