苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析

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：１０４３４分类号：Ｓ７６３．１授予学位单位代码２０１３１１０３９４研究生学号：山東農業大學硕士学位论文苹果腐烂病菌转录因子基因的克隆及功能分析ＣｌｏｎｉｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎａｌｓｉｓｏｆａｎｏｖｅｌＶａｌｓａｍａｌｉｇｙＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＶｍＳｏｍ１研究生：孙庚午学科专业：森林保护学研究方向、果、园林植物病理：林学院：植物保护学院指导教师：刘会香副教授何邦令副教授２０１６年６月５日 论文提交日期：2016年5月论文答辩日期：2016年6月学位授予日期：2016年6月学科门类：农学答辩委员会主席：万鲁长研究员 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名，：Ｈ私导师签名：＾日期－：２ｌｌｌ 目录摘要...................................................................................................................................................IAbstract...........................................................................................................................................III1.前言...............................................................................................................................................11.1苹果腐烂病发生现状...............................................................................................................11.2苹果腐烂病致病机制的研究进展..........................................................................................21.2.1苹果腐烂病菌致病相关物质的研究进展..........................................................................21.2.2苹果腐烂病菌致病相关基因的研究进展..........................................................................31.2.3苹果腐烂病菌效应蛋白研究进展.......................................................................................41.3Som1基因的研究进展..............................................................................................................41.4热不对称交错PCR技术的研究进展....................................................................................71.5转录组测序技术在丝状真菌基因功能研究中的应用........................................................91.6本研究的目的、意义和技术路线........................................................................................101.6.1本研究的目的意义..............................................................................................................101.6.2技术路线...............................................................................................................................112材料与方法.................................................................................................................................122.1实验材料..................................................................................................................................122.1.1供试菌株...............................................................................................................................122.1.2细菌及质粒...........................................................................................................................122.1.3试剂和生化试剂...................................................................................................................122.1.4培养基及溶液配制..............................................................................................................122.1.5实验仪器...............................................................................................................................142.2突变体筛选..............................................................................................................................142.2.1菌株活化及培养..................................................................................................................142.2.2转化子生长速率测定..........................................................................................................142.2.3转化子菌落形态观察..........................................................................................................152.2.4转化子致病性测定..............................................................................................................152.3突变基因的获取.....................................................................................................................152.3.1突变体基因组DNA提取...................................................................................................15I 2.3.2改良hiTAIL-PCR法克隆突变体侧翼序列.....................................................................162.3.3PCR特异性产物回收..........................................................................................................172.3.4PCR特异性产物连接..........................................................................................................182.3.5连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态..............................................................................182.3.6单菌落PCR验证阳性克隆................................................................................................182.3.7侧翼序列对比分析..............................................................................................................192.3.8突变基因的克隆及分析......................................................................................................192.4突变体G23的转录组测序分析...........................................................................................202.4.1菌株的培养...........................................................................................................................212.4.2总RNA的提取....................................................................................................................212.4.3RNA样品检测......................................................................................................................212.4.4RNA文库构建......................................................................................................................222.4.5文库质控和上机测序..........................................................................................................222.4.6测序数据及其质量控制......................................................................................................222.4.7转录组测序数据组装及Unigene功能注释....................................................................222.4.8实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证............................................................................242.4.9差异表达分析......................................................................................................................263结果与分析.................................................................................................................................273.1苹果腐烂病菌致病缺陷突变体表型分析...........................................................................273.2致病缺陷突变体突变基因的克隆........................................................................................293.2.1改良hiTAIL-PCR体系的建立..........................................................................................293.2.2突变基因的克隆和序列分析.............................................................................................303.3Valsamalisdau11-175和突变体G23转录组测序分析.....................................................353.3.1总RNA提取及质量检测...................................................................................................353.3.2测序数据及质量分析...........................................................................................................363.3.3Unigene功能注释和基因表达量分析...............................................................................393.3.4基因表达量的实时荧光定量PCR验证...........................................................................403.3.5差异表达基因分析..............................................................................................................413.3.6差异表达基因GO功能富集分析.....................................................................................423.3.7差异表达基因KOG分类...................................................................................................44II 3.3.8差异表达基因KEGG注释和KEGG通路富集分析.....................................................453.3.9已知V.mali致病相关基因分析........................................................................................463.3.10V.mali转录因子分析.........................................................................................................474讨论..............................................................................................................................................475结论..............................................................................................................................................49参考文献.........................................................................................................................................51致谢..................................................................................................................................................57攻读学位期间发表论文情况........................................................................................................58III 山东农业大学硕士学位论文摘要由Valsamali引起的腐烂病是危害我国苹果树最为严重的生物灾害。明确病菌的分子致病机制对有效防控苹果腐烂病意义重大。本研究在已建立的苹果腐烂病菌（Valsamali）ATMT突变体库的基础上，重点对苹果腐烂病菌突变体G1-G50进行了表型筛选，得到了致病缺失突变体，并对突变基因进行了克隆和序列分析；同时开展了突变体G23和野生菌株sdau11-175的转录组测序分析，初步分析了突变基因在转录水平上的表达和调控作用。研究结果如下：1.突变体G1-G5050个突变体中，仅有G23在生长发育和致病性方面与野生型菌株sdau11-175有明显差异。进一步对突变体G23的表型进行分析，发现G23菌株致病性完全丧失，生长速率明显减慢；与野生型相比，G23气生菌丝生长较弱，菌落表面较为湿润；在25℃黑暗条件下培养，突变体G23始终不产生子实体。2.参照TAIL-PCR、hiTAIL-PCR和FPNI-PCR方法，建立了适合苹果腐烂病菌pBHt2和pKO1-HPH两种载体ATMT突变体的改进hiTAIL-PCR方法，该方法较原始的TAIL-PCR方法有着更高的特异性和扩增效率，能获得更长的特异性产物。3.使用改进的hiTAIL-PCR方法，克隆得到了突变体G23的T-DNA左右侧翼序列。通过Blast比对分析，确定了T-DNA插入突变基因的位置为苹果腐烂病菌第12号染色体69537和69547之间，位于一个编码假定蛋白的基因VMIG_09677第一个外显子内。通过突变基因全长克隆和序列分析，发现该基因与编码camp-dependentproteinkinasepathwayprotein（Som1）基因同源性最高，因此将其命名为VmSom1。VmSom1基因大小为2723bp，编码大小824aa的蛋白质。通过对VmSom1蛋白氨基酸序列进行分析，发现该蛋白与MoSom1（Magnaportheoryzae）和SomA（Aspergillusfumigatus）结构相似，均存在LIM结构域和核定位信号肽。这说明VmSom1蛋白在功能上可能与MoSom1和SomA有着相似性。蛋白同源性分析显示，在丝状真菌中，Som1蛋白在同属真菌内存在高度的同源性，但不同属内同源性较低。这说明VmSom1在功能上可能与MoSom1和SomA有着一定的差异性。4.采用IlluminaHiseq2500高通量测序平台完成了苹果腐烂病菌sdau11-175和突变体G23的转录组测序，共获得11.75GbCleanData。转录组分析表明，G23相对于sdau11-175，共有差异表达基因（DEG）857个，上调表达295个，下调表达562个。对差异表达基因进行了GO分析、KOG分析和KEGG分析，发现大部分差异表达基因I 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析与V.mali的物质运输代谢相关。G23转录组中共有4个肌球蛋白和2个肌动蛋白等11个细胞骨架相关基因出现下调表达，因此VmSom1可能直接或间接调控胞内极性运输。通过比对分析，在G23转录组数据中发现了7个下调表达转录调节因子（2个C2H2锌指型转录因子，1个Zn2Cys6型转录因子、Myb-like转录因子、HMG-box转录因子、Bromodomain转录因子和Velvet转录因子），而这些下调表达转录因子涉及到孢子形成、菌丝性别分化和DNA损伤修复等方面。实时荧光定量PCR验证了18个基因，所有基因的表达趋势均与上述转录组测序结果一致。关键词：苹果腐烂病菌；改良hiTAIL-PCR；VmSom1基因；生长发育；致病性II 山东农业大学硕士学位论文AbstractThecankerdiseasecausedbyValsamaliisthemostseriousbiologicaldisastertotheappletreeinChina.Itisimportantfortheeffectivepreventionandcontrolofapplevalsacankerdiseasetodefinemolecularpathogenesismechanismofthepathogen.,ThispapermainlyscreenedthephenotypeandgotamutantamongG1-G50isolatesbasedonconstructedATMTmutantlibrarybeforeofValsamali,themutantgenewasclonedandsequenced,andthesametime,thetranscriptomeanalysisofmutantG23andwildstrainssdau11-175werecarriedoutandclearedoutthemutantgenesexpressionandregulationroleatthetranscriptionallevel.Theresultswereasfollows:G23mutantwasfoundsignificantlydifferenceonthecolonymorphology,colonygrowthrateandtheabilityoffruitingbodyproductionandpathogenicityamong50isolates.whichshowedslowcolonygrowthrate,myceliumsparse,aneasilywettablephenotype,andnon-pathogeniccomparedwiththewildtypesdau11-175,AmodifiedhiTAIL-PCRmethodwasestablishedbasedonTAIL-PCR,hiTAIL-PCRandFPNI-PCR.ThenestedspecialprimerswereselectedfromthesamesequencesoftheT-DNA’sbothbordersofbinaryvectorpBHt2andpKO1-HPH.ModifiedhiTAIL-PCRmethodhashigherefficiencycomparedwiththetraditionalTAIL-PCR.TheT-DNAbothflankingsequencesofG23wereclonedandsequenced,theT-DNAinsertioninG23waspositionedamong69537-69547,whichwaslocatedoninthefirstexonofahypotheticalgeneVMIG_09677ofchromosome12andnamedafterVmSom1,ithadaLisHdomainattheN-terminalportionandanuclearlocationsignalintheVmSom1protein.theaminoacididentityanalysisandphylogeneticanalysisshowedthatSom1indifferentfilamentousfungigenuswasnotconserved.V.maliwildtypesdau11-175andmutantG23transcriptomewereanalyzedbyusingIlluminaHiseq2500high-throughputsequencingplatform.Atotalof857geneswereidentifiedanddifferentiallyexpressed,295genewereup-regulatedand562weredown-regulated.GOanalysis,KEGGanalysisandCOGanalysiswerefoundthatmanydifferentexpressiongenesassociatedwithmaterialtransportandmetabolism,elevenIII 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析down-regulatedgenewereCytoskeletonproteinincludingfourmyosinandtwoactininG23transcriptome.AlltheresultshowedthatVmSom1mainlydirectlyorindirectlyregulatedthehyphapolargrowthandseventranscriptionfactors(twoofC2H2Zincfingertranscriptionfactor，oneZn2Cys6typetranscriptionfactors、Myb-liketranscriptionfactors、HMG-boxtranscriptionfactors,BromodomaintranscriptionfactorsandVelvettranscriptionfactors)weremayberesponsibleforphenotypeofG23mutant.Keywords:Valsamali;modifiedhiTAIL-PCR;VmSom1gene;Growthanddevelopment;pathogenicityIV 山东农业大学硕士学位论文1.前言1.1苹果腐烂病发生现状苹果是世界性果品，我国苹果产业规模已处于世界领先地位，苹果也是我国第一大果树，2015年我国苹果面积达222.15万公顷，产量3849.1万吨，现已成为果农增产增收和提供生活质量的重要经济支柱。我国苹果种植面积从1978年到2012年增长了156.4万hm2，总产量增长了3621.55万t，但是单位面积产量远低于世界水平，苹果病害的严重发生是导致该现象的重要原因。我国主要有四大苹果产区：环渤海湾产区，西北黄土高原产区，黄河故道产区和西南冷凉高地产区。山东省属于环渤海湾产区，是苹果老产区。至2013年，山东省种植苹果面积为30.34万hm2，苹果产量达930.43万t。虽然山东省苹果产量比陕西省少12.4万t，但是山东苹果种植面积仅为陕西省的1/2，山东省的苹果单位面积产量远超陕西省（陈学森，2015）。因此，山东省的苹果产业为推动区域经济发展，农民收入增加和满足国内消费需求做出了重要贡献。苹果腐烂病（Valsacankerofapple），又称烂皮病，是由苹果黑腐皮壳（Valsamali）引起的枝干皮层腐烂病害。该病害可致苹果树皮腐烂、树势衰弱、产量和品质下降，主要危害苹果主干、大枝，也可危害小枝条，偶尔侵染果实，严重时造成整株死亡（樊民周等，2004；王磊等，2005；臧睿等，2007，李保华等，2013；Wangetal.,2014）。苹果树腐烂病在世界苹果种植区范围内广泛发生，主要集中在亚洲东部地区，如中国、韩国、日本和朝鲜。我国于1916年首次在辽宁省南部地区发现苹果树腐烂病的发生（高克祥等，1995）。该病害后于1948-1953年，1960-1963年，1976年和1985-1987年在我国有过大范围的流行，造成大量植株死亡（曾士迈，2005）。2008年国家苹果产业技术体系对我国10个苹果主产省市的147个苹果园进行了苹果树腐烂病发生和防治情况的调查，结果发现总体发病率达到52.7%，部分地区发病率高达85％以上（曹克强等，2009）。根据2010-2012年的最新调查结果显示，苹果腐烂病在我国所有的苹果种植区内均有发生，且病害发生程度均为重度（胡清玉等，2016）。因此，加强苹果树腐烂病菌的致病机制研究是科学防控苹果树腐烂病的关键和核心问题，病原菌的生长发育及致病作用的发挥均是病原菌中关键致病相关基因或转录因子等在发挥重要作用，因此分离克隆致病相关基因或转录因子，进而分析其在病菌生长发育及侵染致病过程中的作用及代谢调控网络，有助于对苹果树腐烂病菌致病分子作用机制的了解，本研究也为植物病1 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析原菌致病分子机制的理论和实践提供更多的依据，为未来病菌的分子药物设计及寻找新的作用靶点和苹果抗腐烂病菌的分子抗病育种研究开辟了一条新的途径。1.2苹果腐烂病致病机制的研究进展苹果腐烂病是我国苹果树危害最为严重的生物灾害，其致病机制研究我国最为系统和深入。苹果腐烂病菌侵染致病过程是一个相当复杂的互作过程，这一过程有细胞壁水解酶类的参与，也有毒素等小分子、效应蛋白等致病相关基因参与，因此，众多学者紧紧围绕病菌产生的致病相关物质（细胞壁水解酶类、毒素）、致病相关基因、效应蛋白等的分离、鉴定和作用机制进行了大量深入研究，为揭示病菌的致病机制提供了大量的理论和实践数据。1.2.1苹果腐烂病菌致病相关物质的研究进展细胞壁降解酶类：苹果腐烂病菌是一种弱寄生菌，其侵染致病过程是一个相当复杂的过程，研究发现这一过程有细胞壁水解酶类的参与，但不同学者所研究的细胞壁水解酶种类各异。陈晓林等（2012）发现腐烂病菌在侵染致病过程中可产生5种细胞壁降解酶，分别为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶和木聚糖酶，其中木聚糖酶活性最高，对苹果愈伤组织的浸解能力最强，纤维素酶活性最低；刘福昌等（1980）研究发现在被苹果树腐烂病菌腐解的苹果树皮中有果胶酶的存在，并且将该病菌培养在马铃薯麦芽糖培养基中，同样也检测到了果胶酶。臧睿等（2006）也认为果胶酶在病疤的扩展过程中起到重要作用；王建华等（2013）的研究也表明，果胶酶可能是病菌侵染致病的重要因子之一，Ke（2013）利用免疫胶体金技术表明果胶酶与致病过程具有相关性。Ke（2014）从转录组的角度发现细胞壁降解酶和次级代谢产物也与致病性存在密切联系。毒素：苹果腐烂病菌侵染过程中也有毒素等小分子物质的参与，杀死寄主活体细胞，降解活体组织，使皮层坏死腐烂。这些毒素的种类较多，根皮苷的降解产物作为苹果腐烂病菌的毒性因子关注较多，Nishimura等（1982）从苹果树腐烂病菌的发酵液中提取出了5种具有致病活性的代谢产物，且均为根皮苷的降解产物，在感染苹果树腐烂病的树皮病斑中也检测到了这5种物质。发现根皮苷代谢产生的多种有毒物质对于病菌在死细胞中的定殖扩展起到重要作用；Hiroki等（1982）将苹果树腐烂病菌发酵培养后，用2 山东农业大学硕士学位论文乙醚提取滤液，结果发现其提取液能引起与苹果树腐烂病病斑症状相似的树皮坏死，提取液经进一步分离，得到了3种有毒物质，经鉴定分别为根皮酸、对－羟基苯甲酸和原儿茶酸，均为根皮苷的分解产物，同时用离体枝条对这3种物质进行生物测定发现，这些化合物在高浓度下均有毒性，且其毒性对寄主没有专化性；Wangetal.,(2014)也研究发现苹果腐烂病菌可产原儿茶酸,对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酮、3-羟苯基丙酸和间苯三酚5种组分，强致病力菌株5种成分均有，同时病菌产毒素能力与病菌的致病力呈正相关，当毒素浓度达到2.5~40mmol/L，寄主会产生明显的症状。王建华等（2012）报道，苹果树腐烂病菌发酵液的中有机酸对根皮苷的降解也有很大影响；Okuno（1986）在病菌的培养液中分离到了代谢产物异豆香素，并对于分离到的5种分离物进行结构以及致病性的分析，发现这些分离物在离体苹果的嫩枝上具有毒力。1.2.2苹果腐烂病菌致病相关基因的研究进展苹果腐烂病菌的基因组大小为44.7Mb（Yinetal.,2015）。目前，其致病相关基因的分离、鉴定及功能研究是苹果腐烂病菌致病机制研究的热点。苹果病菌致病基因的分离主要采用PEG-Cacl2介导及ATMT（Agrobacteriumtumefaciens-MediatedTransformation，ATMT）技术构建V.mali的突变体库、通过表型筛选获得致病力下降的突变菌株，进而通过侧翼序列的扩增、基因的敲除与互补等同源重组方法、qRT-PCR技术、酵母双杂交或亚细胞定位及基因组测序和转录组分析方法鉴定和研究致病相关基因的功能（高静等，2011；Wangetal.,2013；Huetal.,2014;Keetal.,2014；陈亮等，2014；Chenetal.,2015；Yinetal.,2015；Yinetal.,2016）。宋娜等（2014）发现苹果腐烂病菌GTP环化水解酶IIVmgtp1基因可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝的生长和分生孢子的发育及病菌的致病作用；戴青青（2014）发现苹果腐烂病菌己糖激酶基因Vmgxk1缺失突变体在菌落形态、生长速度、致病性方面，均没有明显差异，但己糖激酶基因Vmhxk1的缺失突变体，其菌落生长速度减慢，菌丝稀疏，接种叶片和枝条后，病斑扩展速度都明显减弱。许力军（2014）研究了苹果树腐烂病菌内切多聚半乳糖醛酸酶Vmpg-4基因与野生型菌株的表型及致病性差异。发现Vmpg-4基因突变株在生长速率、菌落颜色、分生孢子器产生的时间和数量、致病力等方面均没有差异。表明Vmpg-4基因在生物学表型和致病性上并未起到关键作用。上述这些研究为苹果树腐烂病菌分子致病机制研究起到了靶向性，但基因之间的分子互作及其调控网络缺乏大量直接证据，需要继续深入研究。3 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析1.2.3苹果腐烂病菌效应蛋白研究进展大多研究者们认为死体寄生真菌的致病机理就是利用细胞溶解酶以及水解酶类来破坏寄主组织，然而近期的研究却表明死体寄生真菌与植物的互作关系比想象中要复杂的多，它们也像专性寄生菌一样在侵染过程中可以通过调控寄主来达到侵染的目的，同时,死体寄生真菌同样可以向寄主组织内分泌效应蛋白。Li等（2014）通过苹果腐烂病菌全基因组序列分析发现，苹果树腐烂病菌的效应蛋白可以明显抑制寄主效应子激发的免疫系统（ETI）BAX诱导的细胞程序性死亡，说明苹果腐烂病菌效应蛋白激发的寄主免疫系统在苹果与病菌的分子互作中发挥着重要作用，苹果腐烂病菌效应蛋白胁迫寄主激发的免疫系统提供了一种死养生物与寄主互作新模式，这方面研究尚需更多的科学数据验证。1.3Som1基因的研究进展转录因子（transcriptionfactors）是一类可以识别特定的DNA序列，并与其结合调控的蛋白质。转录因子一般是识别基因上游的特异序列，通过与其结合或分离来在转录水平上调节基因的表达。它可以调节基因的表达强度、时空特异性表达和应答外界刺激。其转录调节功能的行使往往十分复杂，一般需要多种不同蛋白因子协同作用。典型的真核生物转录因子包括四个功能区域，即DNA结合区（DNA-bindingdomain）、转录调控区（activationdomain）、核定位信号区（nuclearlocalizationsignal）和寡聚化位点（oligomerizationsite）。有些转录因子还含有蛋白结合区域，可与其他的转录因子互作，进而共同调节下游基因的转录表达。Som1又称为cAMP-dependentproteinkinasepathwayprotein，是作用于环化腺苷酸信号途径（cAMP-PKA）下游的转录因子。目前，研究者对Som1基因在Saccharomycescerevisiae中的同源基因flo8的功能有着较为深入的研究。但是丝状真菌中对Som1基因的功能研究较少，仅有构巢曲霉（Aspergillusnidulans，OefA）、烟曲霉（Aspergillusfumigatus，SomA）和稻瘟病菌（Magnaportheoryzae，MoSom1）三种真菌有所研究。其中，MoSom1和SomA已被证明能使S.cerevisiae的Δflo8突变体恢复单倍体菌株的侵染能力及二倍体菌株形成假菌丝的能力，这说明Som1与flo8均作用于cAMP-PKA信号途径的下游并且有着类似的功能。在A.nidulans中OefA的缺失会导致气生菌丝分化受阻，从而导致菌株呈现蓬松生长的表型（Leeetal.，2005）。4 山东农业大学硕士学位论文病原菌能否附着寄主细胞表面对于病原菌的侵染过程中非常重要，病原菌的附着力主要由细胞表面疏水蛋白、糖链和细胞外间质形成。在S.cerevisiae中，flo8是一个作用于cAMP-PKA信号通路下游的转录激活因子，在PKA的催化亚基Tpk2直接调控下，与转录抑制子Sfl1共同作用于flo11的启动子区域，调控flo11的表达（图1.1）（Panetal.，2002）。进而影响到酵母细胞间的粘附力，使酵母可以牢固附着和穿透培养基生长。图1.1S.cerevisiae中Tpk2调控flo8和Sfl1至flo11启动子Fig.1.1Tpk2controlsbindingofSfl1andFlo8totheFLO11promoterinS.cerevisiae（Panetal.，2002）在M.oryzae中，MoSom1在调控真菌孢子和附着胞的形成、细胞壁的分化、黑色素的沉积、细胞表面的疏水性等形态建成和致病性方面发挥重要作用。ΔMoSom1突变体中多个与稻瘟病菌致病性相关的基因表达下调，而cAMP-PKA信号通路上游的多个基因表达上调。使用FusariumgraminearumSom1同源基因FGSG_02650转化ΔMoSom1突变体，可恢复突变体产孢和形成附着胞的能力，并且恢复病原菌的致病性（闫霞，2012）。MoSom1受MAC1和CPKA的调控，在MAC1或CPKA缺失突变体中，其表达量明显下调，并且与转录因子MoCdtf1和MoStu1有着很强的蛋白互作（图1.2）（Yanetal.，2011）。5 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析图1.2M.oryzae环化腺苷酸信号途径模式图（摘自Yanetal.，2011）Fig.1.2ModelofthecAMP/PKAsignalingpathwayinM.Oryzae在A.fumigatus中，SomA行使着与MoSom1相似的功能，即调控真菌菌丝形态建成和致病性。SomA还可调控多个控制A.fumigatus分生孢子和细胞粘附力转录因子的表达，并且通过ΔPtaB突变体与ΔSomA突变体的相似表型，进一步证明了SomA和PtaB之间存在着协同作用机制（图1.3）（Linetal.，2015）。图1.3A.fumigatus中SomA和SomA-PtaB基因网络模式图（摘自Linetal.，2015）Fig.1.3ModeloftheSomAandSomA-PtaBgeneticnetworkinA.Fumigatus（Linetal.，2015）上述说明Som1基因在调控病原真菌的生长发育及致病过程中发挥着重要作用。我们在苹果腐烂病菌ATMT突变体库的筛选中，发现了菌落生长缓慢，子实体产生及致病6 山东农业大学硕士学位论文性均显著丧失的突变株。推测突变基因一定在病菌基因组中发挥着重要作用，经突变体表型测定、改良TAIL-PCR获得了侧翼序列，并克隆突变基因的全长序列，鉴定突变基因为Som1基因，并将其命名为VmSom1。该基因在苹果腐烂病菌生长发育及病菌致病作用中发挥的作用及分子机制目前尚无相关的研究和报道。1.4热不对称交错PCR技术的研究进展染色体步移技术（genomewalking）是根据基因组DNA的已知片段序列，来逐步获得其临近的未知片段序列的方法。1993年KaryBanksMullis发明聚合酶链式反应（PCR），该技术后被广泛应用于染色体步移。根据是否需要酶切连接，一般可分为两类：一是依赖酶切连接的，如反向PCR（inversePCR）、载体PCR（SSP-PCR）、锅柄PCR（panhandlePCR）等（Trigliaetal.，1988；Shyamalaetal.，1989；Jonesetal.，1992）；二是不需要酶连介导的，如热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、位点寻找PCR（sitefinding-PCR）和依赖限制性酶切位点PCR（restrictionsite-dependentPCR）等（Liuetal.，1995；Tanetal.，2005；Jiangetal.，2007）。后者对DNA质量要求较低，只需设计引物进行PCR反应即可。故其实验成本低且便捷，被研究者广泛应用并发展（李付鹏等，2010；Leonietal.，2011；Tonookaetal.，2009）。热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL-PCR)是一种不需要酶连介导的半随机引物PCR方法。Liu等（1995）首次报道了该方法，并成功用该方法克隆了拟南芥突变品系的侧翼序列。该方法基本原理：根据已知序列片段设计嵌套的三条具有高退火温度的特异性引物（specialprimer，SP），并设计了4条低退火温度的简并引物（arbitrarydegenerateprimer，AD）；从已知序列端向未知序列端，分别用三条SP与一条AD进行三步PCR，第一步反应以基因组DNA为模板，后两步反应以上一步产物为模板；通过热不对称的三步嵌套PCR反应，得到特异性目标片段（图1.4）（Liuetal.，1995）。Sessions等（2002）利用TAIL-PCR技术对近10万个拟南芥转基因品系的T-DNA左侧翼序列进行了扩增，并最终获得了52964个转基因品系的T-DNA插入位置；Song等（2013）利用该方法从沙冬青中分离克隆了肌醇半乳糖苷合酶的基因(AmGS)及其启动子序列（Sessionsetal.，2002；Songetal.，2013）。Mullins等（2001）利用该方法对尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）ATMT（农杆菌介导转化）突变体T-DNA插入位点的左右侧翼序列进行了克隆；Chen等（2011）利用该方法对稻瘟病菌（M.oryzae）7 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析ATMT转化子中T-DNA插入位置进行了大规模鉴定；WangDY等（2014）利用该方法成功克隆了土曲霉（Aspergillusterreus）ATMT突变体T-DNA插入位置。虽然TAIL-PCR因其良好的灵敏性、产物特异性、可重复性以及较低的成本，被广泛应用于各个物种T-DNA（或转座子）插入位置的鉴定和已知序列的侧翼未知序列扩增，但是由于使用AD引物原因，该方法存在反应程序过于繁琐、特异性条带较少和特异性产物较短等缺陷。并且扩增结果存在很大的随机性，有时难以获得阳性克隆，需要变换随机引物已达到实验预期。Liu等（2007）对TAIL-PCR进行了改良，结合了抑制PCR(SuppressionPCR)（Siebertetal.，1995）和位点寻找PCR（sitefinding-PCR）的优点，建立了高效热不对称交错PCR技术（hiTAIL-PCR）并用该方法克隆了转基因水稻T-DNA插入位置。该方法重新设计了未知序列端的简并引物LAD（longarbitrarydegenerateprimer），具体改动如下：在引物的5’端添加了相同的16nt特异性接头AC1，并在接头后添加了NotⅠ限制内切酶酶切位点；引物的3’端的设计借鉴了位点寻找PCR方法，为固定的4个特定碱基（GGAAGGTTCCAACGGT）；中间为类似AD的简并引物，但具有更高的简并性。在第二步PCR反应SP2的5’端添加了与LAD相同的接头序列，并改动了其中的两个碱基。在第二步PCR反应过程中，特异性产物的两端会带有反向互补序列，可形成茎环结构从而抑制PCR反应，这能在很大程度上抑制短链产物的扩增，提高了特异性产物的长度。在反应流程上，仅由LAD完成第一步反应，第二步与第三步反应均由特异性接头引物AC1来完成，这极大的提高了后两步PCR反应的效率，提高了特异性产物的得率。Ruiz等（2010）用该方法分离克隆了转基因草莓中的T-DNA侧翼序列，WangGH等（2013）利用hiTAIL-PCR成功从沃尔巴克氏体（Wolbachia）菌株wSol中克隆到了前噬菌体WO的全基因组序列。虽然hiTAIL-PCR已得到较为广泛的应用，但是该方法还存在着类似TAIL-PCR的缺点，如较多的简并引物组合、反应程序过于繁琐等缺点。WangZ等（2011）公布了一种由TAIL-PCR改进而来的染色体步移方法——fusionprimerandnestedintegratedPCR（FPNI-PCR）。该方法重新设计了未知序列端简并引物，并命名为fusionarbitrarydegenerateprimer（FAD）。该引物在5’端融合了一段31nt特异性接头，并在该接头序列上设计了两条嵌套引物FSP1和FSP2，从而进一步提高产物的特异性。在反应流程上：FPNI-PCR方法在第二步和第三步反应过程中抛弃了热不对称循环，转而使用较高退火温度的正常循环，这极大地简化了反应程序的设置。在第二步反应中，因FSP1有着较低的退火温度，在高退火温度下单由简并引物扩增的非目标片8 山东农业大学硕士学位论文段的扩增效率将会非常的低，这有效减少了非特异条带的数量。在第三步反应中，FSP2有着与SP3相似的较高的退火温度，在两种引物的作用下以指数方式扩增，得到大量的特异性产物。目前已用该方法成功应用于蔷薇科不同物种的同源基因克隆、矮牵牛转录因子基因的启动子的寻找、转基因烟草品系T-DNA插入位点的侧翼序列克隆以及水稻和拟南芥的特定基因克隆（WangZetal.，2011）。图1.4TAIL-PCR原理图（摘自Liuetal.，1995）Fig.1.4PrincipleofTAIL-PCR（Liuetal.，1995）1.5转录组测序技术在丝状真菌基因功能研究中的应用转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。转录组学研究作为明确基因功能的一个重要手段，在庞大的全基因组测序数据挖掘中起9 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析重要作用，它为在基因组测序的基础上进一步明确某物种的生命过程、特定基因的表达、调控、基因互作等问题的解决提供了非常有效的解决方案。转录组研究能够从整体水平上把握物种特定的生物学过程以及疾病发生过程的分子机理。目前，RNA-Seq（RNAsequencing）技术即转录组测序技术，通过转录组测序可以得到特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。因其在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP，以及极高的精确度和极低的检测界限被广泛应用。该技术主要应用于转录本结构研究、转录本结构变异研究、基因表达水平研究、非编码区域功能研究和低丰度全新转录本发现等方面。在丝状真菌基因功能研究中，转录组测序技术也有着较为广泛的应用。柯希望（2013）进行了苹果腐烂病菌侵染苹果枝条的转录组测序分析，发现细胞壁水解酶基因、次生代谢物相关基因和多肽酶基因均存在显著上调表达，明确了病原菌侵染过程中差异表达基因。孟丽（2013）对草菇不同生长发育时期进行了转录组测序分析，发现在同源异形框家族的转录因子是草菇子实体形成的关键转录因子。孙青（2015）对哈茨木霉及其Thga1（GαI蛋白基因）敲除突变体进行了转录组测序分析，发现Thga1的缺失会导致生长、产孢、物质运输、基础代谢和次级代谢等相关基因的差异表达，进一步明确了GαI蛋白基因在木霉cAMP信号途径中的重要作用。吕扬勇（2014）对黑曲霉全局调控因子laeA进行了基因敲除及过表达菌株的构建，并对其进行了转录组测序分析，进一步明确了laeA调控表达的基因范围。1.6本研究的目的、意义和技术路线1.6.1本研究的目的意义山东省属于环渤海湾产区，是苹果老产区。山东省的苹果产业为推动区域经济发展，农民收入增加和满足国内消费需求做出了重要贡献。近年来，随着苹果栽植面积的不断扩大和老产区苹果树龄的不断增大，苹果腐烂病病害问题日渐严重。目前，有关苹果腐烂病菌的分子致病机理依然所知甚少，已不能满足日益发展的绿色植保的需要，对实际生产过程中的指导较弱。本研究通过正向遗传学的方法，对苹果腐烂病菌ATMT突变体库进行筛选，得到致病缺陷突变体和突变基因。并通过转录组测序分析，进一步了解该基因在转录水平上的10 山东农业大学硕士学位论文表达和调控作用，明确该基因在苹果腐烂病菌致病过程中的作用，为苹果腐烂病菌分子致病机制的研究奠定理论基础。1.6.2技术路线11 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析2材料与方法2.1实验材料2.1.1供试菌株苹果腐烂病菌（valsamali）菌株sdau11-175由本实验室分离；苹果腐烂病菌ATMT转化子G1-G50共50个，所有转化子均由本实验室获得。所有菌株均使用打孔器获取直径为6mm的菌饼置于冻存管中，加注20%甘油，4℃低温保存。2.1.2细菌及质粒本研究使用的为大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α，由本实验室保存；克隆载体为pMD18-T（Takara，大连），pEASY-T1（全式金生物，北京）；质粒pCB1003和pCB1532（山东农业大学植物保护学院梁元存副教授惠赠）。2.1.3试剂和生化试剂2×EstaqmixDNA聚合酶、快速琼脂糖凝胶回收试剂盒、DM2000DNAmaker、1kbDNALaddermaker、50bpDNAladdermaker均购自北京康为世纪生物科技有限公司。PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase、RevertAidTM第一链cDNASynthesis试剂盒、Trizol®Reagent均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。SYBRPremixExTaqTM、限制性核酸内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司。Driselase、LysingEnzyme、HygromycinB、甲苯磺丁脲均购自Sigma-Aldrich。DEPC购自北京索莱宝科技有限公司，其余均为国产分析纯。2.1.4培养基及溶液配制（1）PDA培养基：马铃薯200g葡萄糖15g琼脂粉10g加水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（2）LB培养基：胰蛋白胨10g12 山东农业大学硕士学位论文酵母提取物5g氯化钠10g琼脂粉（固体）10g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（3）TB3培养基：酵母提取物3g胰蛋白胨3g蔗糖200g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（4）STCbuffer：山梨醇218.604g1MTris-HCl(pH8.0)50mlCaCl2·H2O7.351g（5）0.5MEDTA（pH8.0）：EDTANa2·2H2O186.1gNaOH20g用NaOH调pH值至8，用去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（6）1MTris-HCl(PH8.0)：Tris121.1gHCl42ml加浓盐酸调pH值至8，加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（7）10%SDS：SDS10g68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH值至7.2，用无菌水定容至100ml，室温保存。（8）2NNaOH：NaOH8g用去离子水定容至100ml，置于塑料容器中，室温保存。（9）3M醋酸钠（pH5.2）：NaAc·3H2O40.8g加冰醋酸调节pH值至5.2，加去离子水定容至100ml，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（10）2×CTAB提取液：CTAB20g1MTris-HCl(pH8.0)100ml0.5MEDTA（pH8.0）40mlNaCl81.8g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。室温保存。（11）SolutionⅠ：1MTris-HCl(pH8.0)25ml13 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析0.5MEDTA（pH8.0）20ml葡萄糖9g加去离子水定容至1L，灭菌：121℃，20min。4℃保存。（12）SolutionⅡ：10%SDS1ml2NNaOH1ml加无菌水定容至10ml，充分混匀，现配现用。（13）50×TAEBuffer：Tris242gEDTANa2·2H2O37.4g冰醋酸57.1ml加去离子水定容至1L，室温保存。（14）10×TBEBuffer：Tris108gEDTANa2·2H2O7.44g硼酸55g加去离子水定容至1L，室温保存。2.1.5实验仪器朗基A300PCR仪，北京六一DYY-8C电泳仪，Eppendorf移液器，冷冻离心机，凝胶成像仪，超净工作台，恒温培养箱，水平摇床，水浴锅，低温槽，高压灭菌锅，Bio-RadCFX-96荧光定量PCR仪等。2.2突变体筛选2.2.1菌株活化及培养低温保存的各菌株均在PDA培养基上，25℃，黑暗培养活化3d。在菌落边缘取直径为6mm的菌饼继代培养。2.2.2转化子生长速率测定以野生型菌株sdau11-175为对照，将供试菌株在PDA平板上，于25℃黑暗培养。分别于2d、3d、5d，使用十字交叉法测定菌落生长直径，计算菌落生长速率。每个菌株14 山东农业大学硕士学位论文3个培养皿重复，实验重复3次。2.2.3转化子菌落形态观察以野生型菌株sdau11-175为对照，使用生长速率测定后的菌落平板，在5d测量完直径后，观察记录菌落的形状、菌落颜色、气生菌丝发达程度。2.2.4转化子致病性测定以野生型菌株sdau11-175为对照，使用观察完菌落形态的菌落平板，在菌落边缘取直径为6mm的菌饼。将购买的大小及成熟度接近一致的红富士苹果洗净、晾干，并用75%乙醇进行表面消毒。用挑针刺伤果实表面，将菌饼接种到果实表面伤口处，并用保鲜膜包裹保湿。每个果实接种同一菌株5个菌饼，实验重复3次。将接种后的苹果放置于培养箱中，25℃黑暗培养。观察病斑的形成时间，并使用十字交叉法测量病斑直径。2.3突变基因的获取2.3.1突变体基因组DNA提取（1）将玻璃纸（cellophane）剪成略小于培养皿直径的圆形，放置于培养皿中，加入少量去离子水，121℃灭菌20min；（2）将灭菌后的玻璃纸贴于PDA平板表面，并将培养基于玻璃纸间气泡赶出；（3）用打孔器在突变体菌落边缘取6mm直径的菌饼，按五点取样法的形式，将菌饼接种到玻璃纸表面，在25℃黑暗培养5d；（4）在玻璃纸表面收集菌丝，称取约2g菌丝置于灭菌研钵中，加入液氮快速研磨，重复3次，至菌丝被研磨成粉状；（5）将菌丝粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml预热的2×CTAB提取液；（6）颠倒混匀，置于水浴锅中，65℃水浴15min，每隔3~4min颠倒混匀一次；（7）室温，10000rpm离心5min，将上清液转移至新离心管；（8）加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），剧烈震荡15s，至液体呈均一乳白色；（9）室温，12000rpm离心10min，将上清液转移至新离心管；15 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析（10）加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃静置沉淀30min；（11）室温，12000rm离心5min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤2次，置于超净工作台下室温干燥5min；（12）加入50μlddH2O，溶解DNA，并置于-20℃保存。2.3.2改良hiTAIL-PCR法克隆突变体侧翼序列采用改良后的高效热不对称交错PCR（hiTAIL-PCR）对突变体侧翼序列进行扩增，简并引物设计参考E.D.Mullins（2001）和Yao-GuangLiu（2007）。以突变体基因组DNA为模板，对其T-DNA插入位点左右侧翼序列进行扩增，并将扩增结果进行比对分析，对其功能进行初步研究。所用引物如表2.1所示：表2.1改进hiTAIL-PCR引物Table2.1theprimersofmodifiedhiTAIL-PCRPrimerSequencesLADACGATGGACTCCAGAGWAGTGNAGWANCANAGAAC1ACGATGGACTCCAGAGRB1ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGRB2GGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCRB3AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGLB1GAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGLB2CGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTLB3CCCGAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT注：W=A/T，N=A/C/G/T，V=A/C/G，B=C/G/T，D=A/G/T；RB为右侧翼序列扩增引物，LB为左侧翼序列扩增引物。改良TAIL-PCR各级反应体系：2×EsTaqmix10μlSpecialprimer（10μM）0.5μlADprimer（10μM）1.5μlTemplate1μlddH2O7μlTotal20μl一级（Primary）反应中，模板为突变体菌株基因组DNA；二级（Secondary）反应、三级（Tertiary）反应中，模板分别为上一级反应产物稀释1000倍。16 山东农业大学硕士学位论文表2.2改良hiTAIL-PCR各级反应程序Table2.2ThermalconditionsformodifiedhiTAIL-PCRReactionFileCycleThermalconditionNo.No.Primary1193℃（2min），95℃（1min）21094℃（30s），60℃（1min），72℃（2min）3194℃（30s），25℃（3min），rampingto72℃over3min,72℃（2min）41594℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），47℃（2min），72℃（2min）5172℃（10min）Secondary6194℃（1min）71594℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），60℃（1min），72℃（2min）94℃（10s），48℃（2min），72℃（2min）8172℃（10min）Tertiary9194℃（1min）103094℃（10s），50℃（1min），72℃（2min）11172℃（10min）各级反应产物均在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以1kbladdermaker为参照，每一级反应产物互为对照，其中第三步产物比第二步产物短约110bp左右的产物条带为特异性产物条带。2.3.3PCR特异性产物回收特异性产物回收使用康为世纪快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤参照说明书。（1）将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量（提前记录离心管重量）。（2）向胶块中加入1倍体积BufferPG。50℃水浴温育，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。（3）柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（SpinColumnsDM）中加入200μlBufferPS，13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（4）将步骤2所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。17 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析（5）向吸附柱中加入450μlBufferPW，13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。重复洗涤一次。（6）13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。室温放置3min，使酒精挥发干净。悬空滴加50μlddH2O，室温放置2min。13,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。2.3.4PCR特异性产物连接将回收的特异性片段连接pMD18-T载体，连接体系：胶回收产物3μlpMD18-T0.5μlSolutionⅠ5μlddH2O1.5μlTotal10μl低温恒温槽中4℃过夜。2.3.5连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态（1）从-80℃冰箱中去出50μl大肠杆菌DH5α感受态离心管，置于冰上融化；（2）将10μl产物连接液全量加入离心管中，颠倒混匀，简短离心；（3）将感受态细胞冰浴30min；（4）42℃热激50s，然后迅速置于冰上，冰浴2min；（5）向感受态细胞中加入550μlLB液体培养基，放置于恒温摇床中，37℃，180rpm，水平振摇1h；（6）取适量菌液均匀涂布于LB（100μl/mlAmp）固体培养基平板表面，37℃倒置培养过夜。2.3.6单菌落PCR验证阳性克隆用灭菌的牙签，在LB培养基表面挑取不同单菌落，重新在含100μl/mlAmp的LB培养基表面划线培养，并分别将牙签在对应的200μlPCR管中搅动数次，在PCR管中加入各反应组分，进行PCR扩增。反应体系如下：18 山东农业大学硕士学位论文2×EsTaqmix10μlRV-Mprimer（10μM）1μlM13-47primer（10μM）1μlddH2O8μlTotal20μl反应程序：1）93℃2min；2）95℃1min；3）94℃30s，55℃15s，72℃1min，循环30次；4）72℃10min；5）4℃forever。取5μlPCR产物，在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，以1kbladdermaker为参照，观察条带的有无及大小。2.3.7侧翼序列对比分析将阳性克隆菌落摇菌后送至华大基因测序，将得到序列用Ape软件进行本地比对分析，剔除pMD18-T序列和pKO1-HPHT-DNA序列，得到侧翼序列在使用NCBIBlastx进行在线分析，并结合西北农林（尹志远等，2015）测得的Valsamali03-8基因组序列使用BioEdit软件进行本地分析，获得T-DNA插入致病相关基因的位置，致病基因全长序列及相关信息。2.3.8突变基因的克隆及分析根据西北农林科技大学测得的Valsamali03-8基因组序列，在致病基因的两端设计引物，在野生型菌株sdau1-175进行克隆，得到VmSom1基因全长序列，并与已知真菌的SOM1基因进行对比分析；在致病性丧失突变体G23中进行克隆，得到含T-DNA的VmSom1全长序列，与VmSom1基因进行对比分析，确定T-DNA的插入位点和方式。使用MEGA6软件对VmSom1蛋白进行系统进化分析，采用neighborjoiningmethod。参比序列及GenBank分类号如表2.3所示：19 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析表2.3参比基因Table2.3InformationofreferencesequencesSequencesnameGenBankNo.NeurosporacrassaSom1AAF75278AspergillusnidulansOefAAAW55626MagnaportheoryzaeMoSom1MGG_04708AspergillusfumigatusSomAXP_746706.1Valsamali03-8Adhesiondefectiveprotein3KUI74346.1Valsamalivar.PyriAdhesiondefectiveprotein3KUI56635.1CandidaalbicansFLO8AAQ03244.1SaccharomycescerevisiaeFLO8DAA07769PhaeoacremoniumminimumSom1XP_007915752.1DiaportheampelinaSom1KKY33496.1ColletotrichumorbiculareSom1ENH79204.1ColletotrichumgloeosporioidesSom1XP_007286727.1ColletotrichumsalicisSom1KXH59444.1EutypalataSom1XP_007794813.1VerticilliumalfalfaeSom1XP_003006356.1MadurellamycetomatisAdhesiondefectiveprotein3KOP49461.1OphiocordycepssinensisSom1EQL01045.1UstilaginoideavirensSom1KDB12219.1FusariumfujikuroiSom1KLP21210.1MetarhiziumguizhouenseSom1KID86110.12.4突变体G23的转录组测序分析为获取较为全面的数据，分别选取了野生型sdau11-175和突变体G23的3d、6d和9d的菌丝提取总RNA，并以三个不同时间的混合样品作为一个样本。20 山东农业大学硕士学位论文2.4.1菌株的培养为了方便菌丝的下一步获取，本实验室采用了玻璃纸平板培养。具体步骤如下：（1）将玻璃纸（cellophane）剪成略小于培养皿直径的圆形，放置于培养皿中，加入少量去离子水，121℃灭菌20min；（2）将灭菌后的玻璃纸贴于PDA平板表面，并将培养基于玻璃纸间气泡赶出；（3）用打孔器在菌落边缘取6mm直径的菌饼，按五点取样法的形式，将菌饼接种到玻璃纸表面，在25℃黑暗培养。2.4.2总RNA的提取总RNA提取试剂采用Trizol®Reagent，研棒研钵均在180℃下干热灭菌，6h；所有使用离心管、tip头等均使用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，并在121℃灭菌20min。其余试剂均为RNAaseFree。具体操作步骤如下：（1）分别在玻璃纸表面收集3d、6d和9d的菌丝，称取约2g菌丝置于灭菌研钵中，加入液氮快速研磨，重复3次，至菌丝被研磨成粉状；（2）将菌丝粉末转入预冷的1.5ml离心管中，加入1ml65℃预热的Trizol提取液；（3）颠倒混匀，置于水浴锅中，65℃水浴15min，每隔3~4min颠倒混匀一次；（4）加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育2min；（5）4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移至新离心管；（6）加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置沉淀10min；（7）4℃，12000rm离心10min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，置于超净工作台下室温干燥5min；（8）加入50μl无RNA酶的水，溶解RNA，并置于-80℃保存。（9）取1μL，1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.4.3RNA样品检测分别采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等，以保证使用合格的样品进行转录组测序。llumina转录组测序由百迈克生物科技有限公司（北京）通过IlluminaHiseq2500测序平台完成。21 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析2.4.4RNA文库构建样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：(1)用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；(2)加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；(4)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。2.4.5文库质控和上机测序文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent2100对文库的浓度和插入片段大小（InsertSize）进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。2.4.6测序数据及其质量控制基于边合成边测序（SequencingBySynthesis，SBS）技术，使用IlluminaHiSeq2500高通量测序平台对cDNA文库进行测序，能够产出大量的高质量Reads，测序平台产出的这些Reads或碱基称为原始数据（RawData），其大部分碱基质量打分能达到或超过Q30。在进行后续分析之前，首先需要确保所用Reads有足够高的质量，以保证序列组装和后续分析的准确。另外，一般RawData中会有极少部分的Reads带有测序引物、接头等人工序列，需要将其从Reads中截除。具体测序数据质量控制如下：(1)截除Reads中的测序接头以及引物序列；(2)过滤低质量值数据，确保数据质量；经过上述一系列的质量控制之后得到的高质量Reads，称之为CleanData。2.4.7转录组测序数据组装及Unigene功能注释使用Trinity软件为高通量转录组测序得到的CleanData进行组装。为了使各样品中22 山东农业大学硕士学位论文表达丰度较低的转录本组装得更完整，对于野生型sdau11-175和突变体G23的测序样品合并组装，可以间接增加测序深度，从而使转录结果更完整，同时也有利于后续的数据分析。Trinity软件首先将测序Reads打断为较短的片段（K-mer），然后将这些小片段延伸成较长的片段（Contig），并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合（Component），最后利用DeBruijn图的方法和测序Read信息，在各个片段集合中分别识别转录本序列。将各样品的CleanData与组装得到的Transcript或Unigene库进行序列比对，比对到Transcript或Unigene的Reads称为MappedReads，MappedReads将用于后续的分析。合格的转录组测序文库是转录组数据分析结果可靠的必要条件，为确保测序文库的质量，从以下3个不同角度对转录组测序文库进行质量评估：(1)通过检验插入片段在Unigene上的分布，评估mRNA片段化的随机性、mRNA的降解情况；(2)通过绘制插入片段的长度分布图，评估插入片段长度的离散程度；(3)通过绘制饱和度图，评估文库容量和比对到Unigene库的Reads（MappedReads）是否充足。使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGGOrthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。采用Bowtie将各样品测序得到的Reads与Unigene库进行比对，根据比对结果，结合RSEM进行表达量水平估计。利用FPKM值表示对应Unigene的表达丰度。FPKM（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionmappedreads）是每百万Reads中来自比对到某一基因每千碱基长度的Reads数目，是转录组测序数据分析中常用的基因表达水平估算方法。FPKM能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。FPKM计算公式如下：cDNAFragmentsFPKMMappedFragments(millions)Transcriptlength(kb)23 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析2.4.8实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证为了验证转录组测序结果的可靠性，从转录组测序结果中随机选取18个基因进行荧光定量PCR验证，选取G6PDH（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）作为内参基因，选用包含75bp内含子的GAPDH基因作为基因组DNA污染检测片段（Yinetal.,2013）。分别提取野生型sdau11-175和突变体G23的总RNA，使用赛默飞世尔（中国）RevertAidTM第一链cDNASynthesis试剂盒进行反转录。具体操作步骤如下：（1）随机引物结合反应体系如下：模板RNA6μlOliga(dT)18引物1μlRNasefreewater5μlTotal12μl将所有组分加入200μlPCR管，混匀后简短离心，于PCR仪中70℃孵育5min。取出后迅速置于冰上极速冷却2min。（2）反转录cDNA第一链合成向以上反应液中加入2μl10mMdNTPmix、4μl5×RecactionBuffer、1μlRNase抑制剂（20u/μl）和1μl逆转录酶（200u/μl），总体系为20μl。混匀后简短离心，置于PCR仪中42℃孵育60min。70℃加热5min终止反应，产物于-20℃保存。使用DNASTAR软件设计实时荧光定量PCR反应引物，引物长度设定在18-24nt之间、TM值在58-60℃之间，产物长度设定在100-300bp之间，引物自匹配和引物间互匹配连续不得超过2个、不连续互补不得超过6个，无引物二聚体和发卡结构，引物扩增效率在90-105%之间。共选取18个基因，每个基因设计三对候选引物，引物列表如下：表2.4实时荧光定量PCR验证引物Table2.4PrimersofqRT-PCRPrimerSequencePrimersequenceC16171-F1TCCTTCCTCTTGGTTCTCCTCATCC17134-R2CTCGCTGTCACGCTCTGTTTC16171-R1GAGGCAATGGCAAGCGAGGC17134-F3GCGAGGCGAAGCAGCAAGC16171-F2CATCAGCCTCCATCAGCACCC17134-R3GTTGGCAGCATCAGCACCGC16171-F3GCCTTCAGCCCATCTTTCCACC19446-F1CTGCCACGACCAACCTGAGC16171-R3CACCGACATCAGCAGAGCAGC19446-R1GTAACAGCACTCCCAATCAAGC24 山东农业大学硕士学位论文C24646-F1CACTCACGACCTTTCCCATCAACC19446-F2GCTTGATTGGGAGTGCTGTTACC24646-R1GAGGATACAGGCGACCAGCC19446-R2CAGACGGCGGCGATGATGC24646-F2AGGGAAAGGAGGTGCGACAGC19446-F3TCGTCGCCATCATCCTGCTCC24646-R2CTTTGCGGCGTTGGTTGATC19446-R3GTAGCCCTGGAAGCCGTGC24646-F3CTGGTCGCCTGTATCCTCATCC13600-F1CGACGGACACCAAGCAGAAGC24646-R3CTCCTCGGTGTTGATGTCCTGC13600-R1GACCCTCTGACGCCTTGATC21983-F1GGACAGCAGTGGCAGAATGAGC13600-F2AAGGCGTCAGAGGGTCAGTTAGC21983-R1GCTTCGTCGCTTCACCTCAC13600-R2GCTCGGGTCGTTGTTCGGC21983-F2GACAGCAGTGGCAGAATGAGAGC13600-F3CGGCACGGAGATGTCAAGCC21983-R2CTGGGCGTTGTTCTCGGTGC13600-R3CATTACGAGTTGCGGTTGGCC16249-F1CCTCAACCCGCCCTCAAACC15945-F1CAACAGAACCAGTGCGAAGAGACC16249-R1CGTCTGCCCATCCATTTGTGTC15945-R1CGATGCCAAACGACCTGCCC16249-F2CCGCCCGTCTTCCATAGCC15945-F2CAAGAAGACTCCAGCCCGACC16249-F3ACGAGACGGACCACGATGCC15945-R2GACCTCCTCGCTCAACCCC16249-R3GACGGGCAACTTCCAACGGC15945-F3ACGCATCCCATCTACACACTCC5423-F1GGTGCTGCGGATGATTGCTTCC15945-R3GTCGCTCGCCTGTATCGCC5423-R1CCTTGACGGTGAGCCCTTTC19370-F1CGCTCCATCACCACCCACC5423-F2GCACCAACATCCTACCAGCACC19370-R1CACGGACAGAGAGAGGAGGAACC5423-R2GACCTGAGCGTGCGTTGCC19370-F2ACTGTTCCTCCTCTCTCTGTCCC5423-F3CCACTGTTTGTTGCGGGCTCC19370-R2CTTCCTGCTTGTCCTTTGTGGTCC5423-R3CCACTCAACCTCCACGCCTC19370-F3CACAAAGGACAAGCAGGAAGCC18134-F1GTCAAACCAAGAGAGCCAAAGGC19370-R3GAGAGGGAGAGGAAAGAGAAGAGTC18134-R1CTTGCCTTGCCTGTTCACCC12324-F1GCCTCCTTCTTTCAGCCTCCC18134-F2GGGTGAACAGGCAAGGCAAGC12324-R1CTTCTTCGCCTCTTCCTCCATTTC18134-R2GTGGTAGGAGTGGGCGGAGC12324-F2CAAACCACTACCTCTCCCTGACC17373-F1GCGAACACCTCCGTCAAGCC12324-R2GTAGTCGGCTCGCTCAGGC17373-R1CGTCTTGTCGCTTGCTGCC12324-F3TCTGGTGTTCTGGTTTGGCTTTGC17373-F2GCCTGCTGTGCCAAGTCCC12324-R3GATTCTTCCCGCCTTCCACATC17373-R2CTTCACACCCTCCTTCCGCC19909-F1CCCATCATCAAGCACACCGTCC17373-F3TGCCGTGCCATCGCTGTGC19909-R1GTCCCTCGCTCGCAACTGC17373-R3CCTGCCCTTCCCGTCAAACTTC19909-F2GGTCCTCCTCCCGCTCAACC6553-F1GCCATTTCCACTTTCGCCCTCC19909-R2GACGGTGTGCTTGATGATGGGC6553-R1GACGATGCGGAGGAGGCTC14004-F1CAAGCAGTGGACAAGCCGTTCC6553-F2CGGTGCTCTCTGATGCTGGC14004-R1GAGGGCGGACAATGGACTC6553-R2CGTGGCGTAGAATCCGTAGTC14004-F2CCCACGGCAGCAACTCAATACC6553-F3CGCCAGAAAGACAACGACAGCC14004-R2CTCCCATCCCACAACGAAGACTC6553-R3CAACACCGCAGTCACCCTTC14004-F4CGGGATGTTTGGCTTCGGAGC13177-F1AGCACTGGGACAACAAGGAAGC14004-R4CACCAGCACACAAGAGATACAGGC13177-R1CTTGCTTCTCTGTCTGCTTCTGTC14004-F3ACTGGGATACACGCACGAGACC13177-F2GGGACAACAAGGAAGCAAAGAACGC14004-R3GATGCCCGAAGCGAGACCC13177-R2CGAAGCGGCAGAAATGAAAGGATC20540-F1CTGACAAGGGAGAAACCGACAACC13177-F3TATGGTGAAGGCGGAGGTCGC20540-R1CATAGAACCGCCAGAACGACAGC13177-R3GAGGCGTTGGTTCTGGGTGC20540-F2TGCGTCAATCAATCCAGTGCTATGC15754-F1AGAAGAGAGACAAAGGCGGCAGC20540-R2CGTCACAAAGTCCCTCAAGTAGT25 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析C15754-R1CACCAAAGCCAGCACCGAGC22721-F1TTCATTCCTGTTGCCGTTGCTGC15754-F2TCTTCTGTCTCTGTAACGGTGTGCC22721-R1GGAACAAGCGGAAACAGAGGCC15754-R2GCTTCGGGATTGCCTGGATC22721-F2AAGGCTGGTGCTGCGATTGC15754-F3CAGCGTTGAGGCAGAGGAAGC22721-R2GCTGGGAACACTGACTGAAAGAGC15754-R3CTATCCCATCCATCCTACCGTCAC22721-F3GCCACAACACTGATGCCTTCGC17134-F1GCAGTTCCTCCTTCCAGTCGC17134-R1CTCCAGGTGTTGCTCGGTTC17134-F2GCCACCAACCAAGCCAGG实时荧光定量PCR使用Bio-RadCFX-96荧光定量PCR仪进行扩增，并使用仪器自带软件进行表达分析。选用83℃进行荧光采集。反应结束后，运行程序65-95℃，获得熔解曲线。RealTimePCR反应体系：2×SYBGEENⅠPCRmix10μlForwardprimer（10mM）1μlReverseprimer（10mM）1μl模板cDNA1μlddH2O7μlTotal20μlRealTimePCR反应程序：94℃1min94℃10s60℃10s40×72℃30s4℃∞2.4.9差异表达分析检测差异表达基因时，使用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集。在差异表达分析过程中采用了Benjamini-Hochberg方法对原有假设检验得到的显著性p值（p-value）进行校正，并最终采用校正后的p值，即FDR（FalseDiscoveryRate）作为差异表达基因筛选的关键指标，以降低对大量基因的表达值进行独立的统计假设检验带来的假阳性。在筛选过程中，将FDR小于0.01且差异倍数FC（FoldChange）26 山东农业大学硕士学位论文大于等于2作为筛选标准。其中，FC表示两样品（组）间表达量的比值。对得到的差异表达基因进行差异表达基因功能注释和富集分析，包括：GO功能富集、COG分类和KEGG通路富集分析。3结果与分析3.1苹果腐烂病菌致病缺陷突变体表型分析通过对野生型菌株sdau11-175和50株突变体进行苹果接种致病性测定，大多数转化子表现出与sdau11-175相似的致病力和相同的生长速率，只有少数突变体表现出了差异，其中仅有突变体G23表现出致病力丧失和生长速率显著减慢。对野生型sdau11-175和各个突变体在培养皿上生长5d的菌落直径进行测量，发现突变体G23、G18、G4和G5等直径明显小于野生型。使用打孔器，在生长5d的菌落打取直径为6mm的菌饼，接种于苹果果实，发现突变体G23致病力完全丧失，不能在果实上产生病斑（图3.1）。进一步对G23进行表型分析，发现相对于苹果腐烂病菌Valsamalisadu11-175，突变体G23表现出气生菌丝生长受限、菌落表面较为湿润的特性。并且在25℃下黑暗培养，突变体G23始终不产生子实体（图3.2）。27 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析图3.1突变体菌落直径和接种后病斑直径Fig.3.1Thecolonydiameterandscabdiameterof50mutants5d正面5d反面病斑30d正面30d反面sdau11-1755d正面5d反面病斑30d正面30d反面G23图3.2突变体G23和野生型sdau11-175菌落形态、产子实体和致病性图Fig.3.2Colonialmorphology,fruitingbodyandpathogenicityofG23andsdau11-17528 山东农业大学硕士学位论文3.2致病缺陷突变体突变基因的克隆3.2.1改良hiTAIL-PCR体系的建立本实验室保存有pBHt2和pKO1-HPH两种载体ATMT转化得到的突变体，使用Ape软件对两个载体的T-DNA序列进行比对，发现两载体在T-DNA的左边界和右边界分别存在283bp和305bp长度的相同序列（图3.3）。为提高克隆效率，以两载体T-DNA相同序列设计了退火温度较高的3条嵌套引物L(R)B1、L(R)B2、L(R)B3作为TAIL-PCR的特异性引物。其中引物LB2与LB3间隔186bp，引物RB2与RB3间隔114bp，用以区分特异性产物。参照hiTAIL-PCR（Liuetal.，2007）和FPNI-PCR（WangZetal.，2011）方法设计嵌套引物，其中L(R)B2不添加5’端接头。简并引物参照Mullins等（2001）的方法设计。由于简并引物5’端接头的引入，该改进相较于原始TAIL-PCR方法，提高了第二步和第三步TAIL反应的效率。新的简并引物更能适应丝状真菌基因组的结合。图3.3pBHt2和pKO1-HPH载体T-DNA左右边界相同序列Fig.3.3ThesamesequencesoftheT-DNA’sbothbordersofbinaryvectorpBHt2andpKO1-HPH注：A：左边界相同序列；B：右边界相同序列。29 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析3.2.2突变基因的克隆和序列分析随机挑选7个苹果腐烂病菌ATMT突变体，使用改良hiTAIL-PCR进行T-DNA侧翼序列扩增。从图3.4可以发现改良hiTAIL-PCR有着良好的扩增成功率，对7个菌株都能获得特异性条带，对右侧翼序列扩增的成功率要高于左侧翼序列。并且产物条带清晰明亮，扩增效率较高。黄定轩等（2014）通过TAIL-PCR方法，克隆15个突变体的T-DNA侧翼序列，仅获得7个条带，远远低于改进后的hiTIAL-PCR方法。图3.4改良hiTAIL-PCR扩增7个突变体侧翼序列产物Fig.3.4TheproductionofsevenmutantsmadebymodifiedhiTAIL-PCR注：L（R）1、L（R）2、L（R）3分别代表第一二三步反应产物，M为DM2000maker，箭头指示条带为特异性条带位置。使用改良hiTAIL-PCR方法以突变体G23和FL550基因组DNA为初始模板，对突变体突变基因进行克隆。其中，我们在突变体FL550的T-DNA左边界获得了约1500bp的特异性片段，在突变体FL550的T-DNA右边界获得了约800bp的特异性片段；在突变体G23的T-DNA左边界获得了约1900bp的特异性片段，在突变体G23的T-DNA右边界获得了约2200bp的特异性片段。不同突变体克隆产物条带如下图所示：30 山东农业大学硕士学位论文图3.5改良hiTAIL-PCR产物电泳条带Fig.3.5ElectrophoreticbandofmodifiedhiTAIL-PCR注：L（R）2、L（R）3分别代表第二三步反应产物，M1为1kbladdermaker，M2为DM2000maker，箭头指示条带为特异性条带位置。分别将两突变体的特异性片段切胶回收，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取单菌落进行PCR验证。选取阳性克隆送至华大基因进行测序，测序结果如下图3.6A所示。使用BioEdit软件，将所获得的突变体T-DNA左右侧翼序列与西北农林科技大学测得的Valsamali03-8基因组（YinZetal.，2015）进行本地序列比对，并结合NCBIGenBank数据，发现突变体G23中的T-DNA插入位点在Valsamali第12号染色体（CM003109.1）的69537和69547之间，位于一个编码假定蛋白的基因VMIG_09677（GenBank:KUI74346.1）第一个外显子内（图3.6B）。发现突变体FL550中T-DNA插入位点在Valsamali第8号染色体（CM003105.1）的2336793和2341108之间，T-DNA置换掉了第8号染色体上共4316bp长度序列。被置换的序列包括VM1G_07985（KUI72281.1）5’端部分序列及其启动子，VM1G_07986（KUI72125.1）部分启动子序列，和两基因间的非编码区序列（图3.6C）。31 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析图3.6突变体T-DNA侧翼序列测序及T-DNA插入位点Fig.3.6T-DNAflankingsequencesandinsertionpositionofmutants注：下划线标注序列为T-DNA序列，其余为突变体基因组序列。在苹果腐烂病菌基因组数据库中VMIG_09677被注释为编码假定蛋白Adhesiondefectiveprotein3的基因，基因大小为2723bp，编码824个氨基酸。因为该基因在NCBI数据库中检索结果其编码一个与Som1同源的预测蛋白，我们将这个基因命名为VmSom1。在Neurosporacrassa中Som1被预测为依赖cAMP-PKA途径的控制极性生长蛋白。设计分别以Valsamalisdau11-175基因组DNA和反转录得到的cDNA为模板，设计引物克隆VmSom1基因全长序列和cDNA序列。我们使用DNAMAN软件将VmSom1基因全长序列与Valsamali03-8Adhesiondefectiveprotein3基因进行序列比对，发现两序列之间共有5个碱基存在差异（图3.7）。这可能是由于两个菌株分离自不同地区的苹果腐烂病组织，而微生物本身有着较低的遗传稳定性。但是我们将克隆到的cDNA序列翻译为氨基酸序列，并与03-8Adhesiondefectiveprotein3氨基酸序列比对后，发现二者氨基酸序列完全一致。32 山东农业大学硕士学位论文图3.703-8和sdau11-175VmSom1序列比对Fig.3.7VmSom1sequencesalignmentof03-8andsdau11-175我们将VmSom1翻译得到的氨基酸序列，并与03-8Adhesiondefectiveprotein3进行序列比对，由于密码子的简并性，二者氨基酸序列完全一致，这说明同种真菌内该蛋白具有相同的功能。sdau11-175中VmSom1与不同真菌的同源序列氨基酸一致性分别为：NeurosporacrassaSom1（AAF75278）54.65%，AspergillusnidulansOefA（AAW55626）35.53%，MagnaportheoryzaeMoSom1（MGG_04708）53.11%，AspergillusfumigatusSomA（XP_746706.1）40.78%，Valsamali03-8Adhesiondefectiveprotein3（KUI74346.1）100%，CandidaalbicansFLO8（AAQ03244.1）17.89%，SaccharomycescerevisiaeFLO8（DAA07769）12.56%，PhaeoacremoniumminimumSom1（XP_007915752.1）65.92%，DiaportheampelinaSom1（KKY33496.1）76.26%，ColletotrichumorbiculareSom1（ENH79204.1）60.37%，ColletotrichumgloeosporioidesSom1（XP_007286727.1）60.26%，ColletotrichumsalicisSom1（KXH59444.1）59.52%，EutypalataSom1（XP_007794813.1）57.84%，VerticilliumalfalfaeSom1（XP_003006356.1）57.21%，MadurellamycetomatisAdhesiondefectiveprotein3（KOP49461.1）51.25%，OphiocordycepssinensisSom1（EQL01045.1）53.58%，UstilaginoideavirensSom1（KDB12219.1）57.06%，FusariumfujikuroiSom1（KLP21210.1）58.31%，MetarhiziumguizhouenseSom1（KID86110.1）56.56%，以及Valsamalivar.PyriAdhesiondefectiveprotein3（KUI56635.1）98.79%。系统进化分析显示，Som1氨基酸序列在同属真菌内有着很高的相似性，而在不同属真菌内则差异较大。由于蛋白的一级结构决定高级结构，因此我们推测不同属真菌的Som133 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析蛋白功能可能存在一定差异（图3.8）。91Colletotrichumorbiculare100ColletotrichumgloeosporioidesNaragc599Colletotrichumsalicis96VerticilliumalfalfaeVaMs.102FusariumfujikuroiOphiocordycepssinensisCO188310098Ustilaginoideavirens99MetarhiziumguizhouenseARSEF977100EutypalataUCREL1Magnaportheoryzae70-1592Neurosporacrassa33Madurellamycetomatis45PhaeoacremoniumminimumUCRPA7100Diaportheampelina85Valsamalivar.pyri100100Valsamali03-896Valsamalisdau11-175Aspergillusnidulans100AspergillusfumigatusAf293CandidaalbicansSaccharomycescerevisiae0.05图3.8苹果腐烂病菌VmSom1蛋白的NJ系统进化分析Fig.3.8NJPhylogeneticanalysisofVmSom1proteinofvalsamaliflo8（S.cerevisiae）、MoSom1（M.oryzae）和SomA（A.fumigatus）中，在氨基酸的N端都存在一个LisH。并且在MoSom1和SomA中都存在核定位信号肽。我们使用http://smart.embl-heidelberg.de/index2.cgi在线工具对VmSom1进行氨基酸序列分析，在VmSom1蛋白的N端43-75aa位置也发现了一个长为33aa的LisH结构域，氨基酸序列为NKHLLNTYIYEYFLRNEMYDCARAILSSDPQIK。经http://nls-mapper.Iab.Keio.Ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi预测，在VmSom1蛋白的259-272aa处发现了一个长为14aa的核定位信号肽（NLS），氨基酸序列为PSPSKRPRFEGGPF。这说明VmSom1可能与MoSom1和SomA有着相似的功能，并且同样在细胞核中发挥功能。通过NCBI的ConservedDomains对VmSom1、MoSom1和SomA进行保守结构域预测，发现三种Som1蛋白均存在相似的结构域如M_domain和DUF1720superfamily等。如图3.9所示：34 山东农业大学硕士学位论文图3.9VmSom1、MoSom1和SomA保守结构域预测Fig.3.9VmSom1,MoSom1andSomApredictionofConservedDomain3.3Valsamalisdau11-175和突变体G23转录组测序分析3.3.1总RNA提取及质量检测采用Trizol®Reagent提取苹果腐烂病菌野生型sdau11-175和突变体G23的总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，28s和18srRNA条带清晰，这说明总RNA降解程度小、完整度高（图3.10）。经Nanodrop和Aglient2100检测，各样品纯度、浓度和完整性等均合格，可进行转录组测序（表3.1）。图3.10G23和sdau11-175两菌株总RNA电泳检测Fig.3.10RNAelectrophoreticbandoftheG23andsdau11-175strains35 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析表3.1G23和sdau11-175两菌株总RNA质量检测结果Table3.1TheresultsofthetotalRNAoftwostrainbyAgilent2100菌株RIN值28S/18S基线OD260/OD280OD260/OD230G239.51.4正常2.101.96sdau11-1758.51.3正常2.061.813.3.2测序数据及质量分析苹果腐烂病菌sdau11-175和突变体G23转录组测序产量分别为6,091,728,804bp和5,659,894,800bp，共获得11.75GbCleanData，各样品CleanData均达到5.66Gb，Q30碱基百分比在89.76%及以上，碱基错误率极低（表3.2）。测序碱基含量分布正常，G和C、A和T的含量每个测序循环上分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。因此本研究获得的转录组数据质量是合格的，可以进行后续组装分析。表3.2样品G23和sdau11-175测序数据评估统计结果Table3.2TheresultoftranscriptomesequencingdataqualityassessmentStrainReadNumberBaseNumberGCContent%≥Q30G2322,459,9005,659,894,80056.01%89.76%sdau11-17524,173,5276,091,728,80455.54%89.76%为了间接增加测序深度，从而使转录结果更完整，同时也有利于后续的数据分析，本研究将两样品转录组测序获得的11.75GbCleanData进行合并组装。通过Trinity软件组装，共得到76,093条Transcript和60,766条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为1,751和1,227，组装完整性较高，组装结果统计如表3.3所示：36 山东农业大学硕士学位论文表3.3转录组数据组装结果统计表Table3.3ThestatisticsresultoftranscriptomeassemblyLengthRangeTranscriptUnigene200-30025,363(33.33%)23,898(39.33%)300-50018,615(24.46%)16,506(27.16%)500-100013,304(17.48%)9,957(16.39%)1000-20009,837(12.93%)5,886(9.69%)2000+8,974(11.79%)4,519(7.44%)TotalNumber76,09360,766TotalLength66,238,49641,820,760N50Length1,7511,227注：LengthRange：表示Transcript/Unigene的不同长度区间；表格中的数字表示相应区间内Transcript/Unigene的数量，括号内的百分比表示相应长度区间内Transcript/Unigene所占的比例；TotalNumber：表示组装得到的Transcript/Unigene的总数；TotalLength：表示组装得到的Transcript/Unigene的总长度；N50Length：表示Transcript/Unigene的N50的长度。合格的转录组测序文库是转录组数据分析结果可靠的必要条件，为进一步确保测序文库的质量，本研究从以下2个不同角度对转录组测序文库进行质量评估：（1）mRNA片段化随机性检验。我们通过MappedReads在各Unigene上的位置分布，模拟了mRNA片段化结果，检验mRNA片段化的随机程度。各样品的曲线较平滑，说明mRNA片段化随机性较高；而曲线两端斜率较大，说明样品的3’端和5’端存在一定的降解；曲线中间部分斜率很小，说明各样品不存在严重降解现象（图3.11）。37 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析图3.11MappedReads在mRNA上的位置分布图Fig.3.11ThepositionofreadsmappedonmRNA(2)转录组测序数据饱和度检验。通过绘制饱和度图，我们发现在现有的MappedReads下，各样品检测到的基因数目均已达到饱和，说明本研究的转录组测序数据是相当充足的（图3.12）。图3.12转录组测序数据饱和度模拟图Fig.3.12Thesaturationsimulationoftranscriptomedata38 山东农业大学硕士学位论文3.3.3Unigene功能注释和基因表达量分析本研究使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGGOrthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。通过设置BLAST参数E-value不大于1e-5和HMMER参数E-value不大于1e-10，最终获得34,952个有注释信息的Unigene。如表3.4所示：表3.4苹果腐烂病菌Unigene注释统计表Table3.4TheresultofUnigeneannotationofV.maliAnnotatedDatabaseAnnotatedNumber300<=length<1000ntlength>=1000ntCOGAnnotation1214349254130GOAnnotation1752585042947KEGGAnnotation1061247023633KOGAnnotation2003087005482PfamAnnotation2224195217588Swiss-protAnnotation1310250385787NRAnnotation28356125907058AllAnnotated34952151198970采用Bowtie将各样品测序得到的Reads与Unigene库进行比对，根据比对结果，结合RSEM进行表达量水平估计。利用FPKM值表示对应Unigene的表达丰度。两转录组基因表如下图所示：基因表达水平FPKM值横跨10-2到104六个数量级，主要集中在10-1到102之间。图3.13sdau11-175和G23基因表达量（FPKM）分布图Fig.3.13Genesdistributedindifferentexpressionlevel(FPKM)oftwostrain39 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析3.3.4基因表达量的实时荧光定量PCR验证本研究随机挑选了18个基因，每个基因设计了3对候选引物。通过普通PCR验证，我们在共54对候选引物中，成功筛选出了18对对应不同基因的荧光定量引物。这18对引物特异性好，扩增效率高，在扩增过程中不产生杂带和引物二聚体。如表3.5所示：表3.5qRT-PCR引物Table3.5TheprimersofqTR-PCRGeneForwardprimerReverseprimerlengthC16171GCCTTCAGCCCATCTTTCCACCACCGACATCAGCAGAGCAG230bpC24646CACTCACGACCTTTCCCATCAACGAGGATACAGGCGACCAGC138bpC21983GACAGCAGTGGCAGAATGAGAGCTGGGCGTTGTTCTCGGTG193bpC16249ACGAGACGGACCACGATGCGACGGGCAACTTCCAACGG311bpC5423GCACCAACATCCTACCAGCACGACCTGAGCGTGCGTTGC255bpC18134GGGTGAACAGGCAAGGCAAGGTGGTAGGAGTGGGCGGAG232bpC17373GCCTGCTGTGCCAAGTCCCTTCACACCCTCCTTCCGC244bpC6553CGGTGCTCTCTGATGCTGGCGTGGCGTAGAATCCGTAGT154bpC15754TCTTCTGTCTCTGTAACGGTGTGCGCTTCGGGATTGCCTGGAT209bpC17134GCAGTTCCTCCTTCCAGTCGCTCCAGGTGTTGCTCGGTT174bpC19446CTGCCACGACCAACCTGAGGTAACAGCACTCCCAATCAAGC117bpC13600AAGGCGTCAGAGGGTCAGTTAGGCTCGGGTCGTTGTTCGG210bpC15945CAAGAAGACTCCAGCCCGACGACCTCCTCGCTCAACCC167bpC12324GCCTCCTTCTTTCAGCCTCCCTTCTTCGCCTCTTCCTCCATTT232bpC19909CCCATCATCAAGCACACCGTCGTCCCTCGCTCGCAACTG128bpC14004CAAGCAGTGGACAAGCCGTTCGAGGGCGGACAATGGACT218bpC20540CTGACAAGGGAGAAACCGACAACCATAGAACCGCCAGAACGACAG150bpC22721AAGGCTGGTGCTGCGATTGGCTGGGAACACTGACTGAAAGAG191bpG6PDHTCAGAACAAGTTCGAGGGCGACAATGAGGGCAATAGAGGGCTTGTTCA158bpGAPDHTACACTGCCACCCAGAAGACCGCGTCGAAGATGGAGGAGTT350bp选用G6PDH（Yinetal.，2013）作为内参基因，对18个基因进行实时荧光定量。40 山东农业大学硕士学位论文使用ΔΔCt法，所有基因Ct值先与内参G6PDH的Ct值作差得到ΔCt，然后两样本间相同基因的ΔCt得到ΔΔCt。经比较分析发现，实时荧光定量PCR和转录组测序检测结果，部分基因差异表达倍数有较大偏差，但基因差异表达的上下调趋势一致（图3.14）。这说明本研究获得的转录组测序基因表达数据是可靠的。图3.14转录组测序和qRT-PCR确定的18个基因相对表达量结果Fig.3.14Therelativetranscriptlevelofeighteengenesbytwomethods3.3.5差异表达基因分析检测差异表达基因时，使用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集。使用FDR（FalseDiscoveryRate）作为差异表达基因筛选的关键指标，以降低对大量基因的表达值进行独立的统计假设检验带来的假阳性。在筛选过程中，将FDR小于0.01且差异倍数FC（FoldChange）大于等于2作为筛选标准。其中，FC表示两样品（组）间表达量的比值。我们发现，相对于野生型sdau11-175，突变体G23中共有857个差异表达基因（DifferentiallyExpressedGene，DEG），其中上调表达基因和下调表达基因数目分别为295（34.42%）和562（65.58%）。如图3.15所示：41 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析图3.15野生型sdau11-175和突变体G23差异表达基因Fig.3.15Thedifferentialexpressiongene(DEG)numberoftwostrain3.3.6差异表达基因GO功能富集分析共有127个DEG被注释到GO数据库，对样品组间差异表达基因（DEG）以及所有基因在GO二级节点进行注释，如图3.16所示。42 山东农业大学硕士学位论文图3.16差异表达基因GO二级节点注释统计图Fig.3.16GOfunctionalclassificationmapofDEG共有92个差异表达基因注释到生物学过程（BiologicalProcess）的35个不同的功能节点，主要集中在代谢过程（metabolicprocess）、细胞过程（cellularprocess）和单组织过程（single-organismprocess）二级节点。其中代谢过程（metabolicprocess，GO:0008152）（16，17.39%）和氧化降解过程（oxidation-reductionprocess，GO:0055114）（17，18.48%）占有较多的差异表达基因。共有106个差异表达基因注释到分子功能（Molecularfunction）38个不同的功能节点，主要集中在催化活性（catalyticactivity）和结合（binding）二级节点。其中氧化还原酶活性（oxidoreductaseactivity，GO:0016491）（13，12.26%）、催化活性（catalyticactivity，GO:0003824）（11，10.38%）和三磷酸腺苷结合（ATPbinding，GO:0005524）（10，9.43%）占有较多的差异表达基因。共有40个异表达基因注释到细胞组分（Cellularcomponent）19个不同的功能节点，主要集中在细胞部件（cellpart）和膜组分（membranepart）二级节点。其中膜有机组成部分（integralcomponentofmembrane，GO:0016021）（9，22.50%）和细胞质（cytosol，GO:0005829）（9，22.50%）占有较多的差异表达基因。利用topGO对样品的差异表达基因进行功能富集，发现生物学过程、细胞组分、分43 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析子功能均未有差异表达基因显著富集。这说明VmSom1基因对各种物质代谢和转运过程均存在影响，VmSom1可能通过影响V.mali物质代谢转运影响V.mali的生长等方面。3.3.7差异表达基因KOG分类利用KOG数据库对差异表达基因产物进行直系同源分类，如图3.17所示：共有252个差异表达基因，分布在21个不同的功能类中。差异表达基因主要集中在次生代谢产物的合成运输代谢（secondarymetabolitiesbiosynthesis,transportandcatabolism）（46，18.25%），其次为能量产生与转化（Energyprodutionandconversion）（22，8.73%）、碳水化合物运输和代谢（Carbohydratetransportandmetabolism）（22，8.73%）和脂质运输与代谢（Lipidtransportandmetabolism）（25，9.92%）。除此之外，有72个基因涉及到一般功能预测蛋白功能类（20%）。图3.17差异表达基因KOG注释分类统计图Fig.3.17KOGfunctionanalysisofDEG本研究发现VmSom1对各种物质运输代谢和能量产生与转化方面均有较大影响。在次生代谢产物的合成运输代谢分类下，细胞色素P450类占的比例较高（24，52.17%），且均为下调表达。细胞色素P450为膜结合蛋白，参与细胞的氧化磷酸化以及次生物质44 山东农业大学硕士学位论文合成、分解等多种代谢过程。因此，VmSom1可能通过调控P450的表达而影响V.mali有关代谢过程。在碳水化合物运输和代谢分类下，大部分为糖基水解酶家族蛋白和MFS蛋白，因此VmSom1可能对细胞壁的合成有着较大的影响。3.3.8差异表达基因KEGG注释和KEGG通路富集分析共有121个差异表达基因被注释到不同的KEGG直系同源组（KEGGOrthology），将注释结果按照KEGG中通路类型（KEGGPathway）进行分类。其中溶酶体（Lysosome）、紧密结合（Tightjunction）和戊糖葡萄糖醛酸转换（Pentoseandglucuronateinterconversions）占有较多的DEG，各为7个。其次为氨基糖核苷酸糖代谢（Aminosugarandnucleotidesugarmetabolism，6）、色氨酸代谢（Tryptophanmetabolism，5），甘氨酸苏氨酸丝氨酸代谢（Glycine,serineandthreoninemetabolism，5）。利用富集因子（EnrichmentFactor）分析Pathway的富集程度，并利用Fisher精确检验方法计算富集显著性。结果如图3.18所示：图中每一个图形表示一个KEGG通路，通路名称见右侧图例。横坐标为富集因子（EnrichmentFactor），表示差异基因中注释到某通路的基因比例与所有基因中注释到该通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示差异表达基因在该通路中的富集水平越显著。纵坐标为log10(Qvalue)，其中Qvalue为多重假设检验校正之后的Pvalue。因此，纵坐标越大，表示差异表达基因在该通路中的富集显著性越可靠。该图挑选了富集显著性最可靠（即Q值最小）的前20个通路进行结果展示。以纵坐标大于1.0、横坐标大于10作为筛选标准，我们得到了4个参考价值较大的KEGGpathway，分别为溶酶体（7，8.43%）、戊糖与葡萄糖醛酸转换（7，8.43%）、紧密结合（7，8.43%）、其它多糖降解（4，4.82%）和类胡萝卜素生物合成（2，2.40%）等。pathway中的差异表达基因数/所有差异表达基因数富集因子pathway中的所有基因数/KEGG中所有的基因数通过分析发现Tightjunction中，7个差异表达基因均为肌动蛋白（actin）和肌球蛋白（myosin），且都为下调表达。对KOG分类中细胞骨架（Cytoskeleton）进行检索，共发现11个差异表达基因均为下调表达，且大部分为肌动蛋白和肌球蛋白。这说明，VmSom1可能影响到胞内物质定向运输和有丝分裂，从而影响到菌丝的极性生长（polargrowth）。这可能与突变体G23生长缓慢有关。45 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析同时发现Lysosome中，有一个鞘磷脂磷酸二酯酶基因（sphingomyelinphosphodiesterase）出现下调表达。而李少杰（2010）在研究中发现鞘磷脂对丝状真菌的形态发育起着调控作用。图3.18差异表达基因KEGG通路富集散点图Fig.3.18KEGGpathwayenrichmentofDEG3.3.9已知V.mali致病相关基因分析在先前对Valsamali致病相关基因的研究中已经证实，效应器蛋白基因VmEP1（LiZPetal.，2015），己糖激酶基因Vmhxk1（戴青青，2014），多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpgx1、Vmpgx2、Vmpgx3和Vmpgx4（宋娜，2014），GTP-环化水解酶Ⅱ基因Vmgtp1（宋娜等，2014），果胶酶基因Vmpg-3（柯希望，2013），阿魏酸酯酶基因VmFaeC1、VmFae1、VmFaeB1、VmFaeC2和VmFaeA1（许铭，2015），编码假定蛋白基因Vm1200（胡阳，2015）均与致病性相关。在本转录组中对比查找，发现仅有一个多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpgx4（本转录组中基因编号为c22721）表现出下调表达。这说明VmSom1调控V.mali致病性的方式可能与已知的V.mali致病机制，如细胞壁水解酶和效应蛋白有所不同。46 山东农业大学硕士学位论文3.3.10V.mali转录因子分析本研究通过对差异表达基因集进行分析，发现了10个差异表达转录因子，其中上调表达3个，下调表达7个。主要为3个Zn2Cys6型转录因子和3个C2H2锌指型转录因子，还包括1个Myb-like转录因子、HMG-box转录因子和Velvet转录因子。在M.oryzae和A.fumigatus中，MoSom1和SomA均位于cAMP-PKA信号通路环磷酸腺苷激酶A（cPKA）下游。并对部分下游与孢子产生、菌丝生长和致病性等有关的转录因子存在表达调控或蛋白互作。其中，MoSom1与转录因子MoStu1和MoCDTF1存在蛋白互作，但MoSom1的缺失不会影响其他基因的表达；SomA可对VelC、FlbB、FlbD、StuA、BrlA等转录因子起直接表达调控作用（Yanetal.，2011；Linetal.，2015）。经比对分析发现，c18134、c13045和c14736分别与FlbD、VelC和BrlA有着较高的同源性，并且在G23转录组中均表现出下调表达。而StuA和MoStu1的同源基因c18656却没有出现差异表达。这说明VmSom1可能存在与MoSom1和SomA相似的转录调控作用，并且其调控方式可能与MoSom1更为接近。4讨论本研究对苹果腐烂病菌sdau11-175的ATMT突变体库中50株突变体进行了筛选，发现大量突变体在菌落形态、生长速率和致病性等方面均没有明显变化，这与黄定宣等（2014）的研究结果是一致的。这可能是由于农杆菌介导转化过程中T-DNA的插入是随机的，大量的突变发生在非编码蛋白序列和非调控序列。因此利用正向遗传学的手段，对ATMT获得的突变体库进行筛选及突变基因克隆，进而对苹果腐烂病菌的功能基因进行研究，工作将会是非常繁重、复杂，并且效率低下的。但是该方法对于发现病原菌致病相关等方面的新关键基因是不可或缺的。Ke等（2014）和Yin等（2015）对苹果腐烂病菌进行了转录组和全基因组测序分析，基于两位学者的工作，利用反向遗传学的技术手段可以极大地提高对苹果腐烂病基因功能的研究效率，这为研究苹果腐烂病菌致病相关基因和致病机制提供了新的途径。本研究首次使用改进的hiTAIL-PCR法对苹果腐烂病菌的ATMT突变体进行了T-DNA左右侧翼序列克隆。由于引入了接头简并引物，该方法相较于TAIL-PCR提高了克隆效率；并且利用抑制PCR的原理有效地降低了短链产物的产生。黄定轩等（2014）47 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析通过TAIL-PCR方法，克隆15个苹果腐烂病菌突变体的T-DNA侧翼序列，仅获得7个条带，远远低于改进后的hiTIAL-PCR方法（9个突变体，15个条带）。因此Mullins设计的简并引物有着更高的克隆成功率，更适合于真菌的染色体步移。这个改进使我们能更有效的获取更多更好的突变体T-DNA侧翼序列信息。在过去对苹果腐烂病菌ATMT突变体的研究中，如戴青青（2014）、程明明（2014）和胡阳（2015）等仅对突变体T-DNA右侧翼序列进行了克隆。本研究通过对突变体FL550左右侧翼序列的分析，发现ATMT过程中，农杆菌除了将T-DNA随机插入染色体外，也存在将染色体部分序列大量切除并置换的情况。因此，只对T-DNA的单边侧翼序列克隆可能会忽略许多必要的突变信息，从而导致研究方向的错误。由于VmSom1蛋白功能的缺失，苹果腐烂病菌突变体G23表现出：菌丝生长受到严重抑制，菌落表面湿润，致病性和产孢能力完全丧失。这与Yan等（2011）和Lin等（2015）对MoSom1和SomA功能的研究结果是一致的。本研究还对VmSom1编码的假定蛋白序列进行了分析，发现VmSom1蛋白与MoSom1和SomA蛋白结构相似，在蛋白N端都存在LisH结构域，并且在蛋白中均存在有核定位信号肽。这些都说明了在丝状真菌中Som1的作用部位和功能可能有着很高的相似性，VmSom1极有可能也是存在与cAMP-PKA信号途径的关键基因，在细胞核中起着转录调控的作用。本研究对野生型菌株sdau11-175和突变体G23进行了转录组测序，发现在两个菌株中有857个基因出现了差异表达，并且大部分差异表达基因为表现出下调表达。通过GO功能富集、KOG分析和KEGG分析，本研究发现大部分差异表达基因与V.mali的能量产生和物质运输代谢相关，但GO功能和KEGG代谢通路均没有显著富集，这给后续分析带来了一定难度。对已知致病相关基因进行检索，发现仅有一个多聚半乳糖醛酸酶基因在差异表达基因集中下调表达。这说明VmSom1调控V.mali致病性的方式可能与已知的V.mali致病机制，如细胞壁水解酶和效应蛋白有所不同。但本研究同时发现突变体次生代谢相关基因出现大量下调表达，这说明突变体G23致病性缺失可能与真菌毒素缺失相关。G23转录组中还存在大量下调表达的肌动蛋白和肌球蛋白，这说明VmSom1影响了苹果腐烂病菌细胞内物质极性运输和有丝分裂，并进一步影响到菌丝的极性生长。本研究发现了几个关键的转录因子在本转录组中出现下调表达，这为进一步研究VmSom1下游关键基因和调控机制提供了较为明确的方向。由于目前国内外学者对苹果腐烂病菌的基因功能研究较少，本研究并没有发现导致突变体G23出现如此大的变化的VmSom1的关键下游基因。但是本研究获得了受VmSom1调控的下游基因的集合，通过48 山东农业大学硕士学位论文对下调表达基因的研究进一步，可以使我们尽快了解其作用机理。鉴于突变体G23相对于野生型sdau11-175，在表型和转录水平上均存在着巨大的差异，因此需要对VmSom1基因本身进行进一步的研究。利用反向遗传学的手段，对VmSom1进行基因敲除和回补可以帮助我们进一步了解VmSom1的功能。结合转座子名片技术（Transposoncallingcards）等实验技术（Mayhewetal.，2016），获得与VmSom1蛋白结合的DNA序列，探索受VmSom1转录因子调控的基因。可以通过构建酵母双杂交文库来筛选与VmSom1互作的蛋白。为了明确VmSom1的调控网络，也可以对转录组中下调表达的转录调节因子进行基因敲除和回补，并对其进行转录组分析，明确其在调控网络中所处位置。5结论本研究以苹果腐烂病菌ATMT突变体库中50个突变体为材料，通过菌落形态、生长速率和致病性分析，获得了一株致病性完全丧失的突变体。使用改良hiTAIL-PCR方法成功获取了突变基因，对突变基因进行了克隆、分析，对其编码的假定蛋白序列进行了分析。并对突变体和野生型菌株进行了转录组学分析。结论如下：1.从苹果腐烂病菌突变体库中筛选到了一株致病性完全丧失的突变体G23。该突变体表现出菌丝生长速率减慢、菌落表面潮湿、不产生子实体和致病力完全丧失的特征。2.建立了适合苹果腐烂病菌pBHt2和pKO1-HPH两种载体ATMT突变体的改进hiTAIL-PCR方法，该方法较原始的TAIL-PCR方法有着更高的特异性和扩增效率，能获得更长的特异性产物，更适应于苹果腐烂病菌ATMT突变体库的T-DNA侧翼序列克隆。3.获得了G23T-DNA的左右侧翼序列，并将突变基因命名为转录因子基因VmSom1，其基因大小为2723bp，编码824个氨基酸，其与真菌中编码Som1、MoSom1和SomA蛋白的基因结构相似，在蛋白N端均存在LisH结构域和在蛋白中均存在核定位信号肽。并且突变体G23与ΔMoSom1和ΔSomA都表现出生长减慢、致病性丧失、不产孢和子实体的相似表型。通过系统进化分析，发现不同属中Som1蛋白序列差异较大。认为VmSom1可能与MoSom1和SomA有着相似的功能，但是其功能行使方式存在差异性。4.sdau11-175野生型菌株和G23突变株转录组分析共发现857个受VmSom1调控49 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析的基因，其中上调表达基因295个，下调表达基因562个。发现大部分差异表达基因与V.mali的能量产生和物质代谢相关，但未获得显著富集的功能节点和代谢通路。在转录组中发现肌动蛋白和肌球蛋白等11细胞骨架相关基因均出现下调表达，VmSom1可能直接或间接控制胞内物质极性运输和有丝分裂。发现了7个下调表达的转录调节因子（2个C2H2锌指型转录因子，1个Zn2Cys6型转录因子、Myb-like转录因子、HMG-box转录因子、Bromodomain转录因子和Velvet转录因子），这些下调表达转录因子涉及到孢子形成、菌丝性别分化和DNA损伤修复等方面。50 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山东农业大学硕士学位论文致谢转眼间三年的研究生生活就过去了，这三年里我学到了很多，不仅学到了实验技术、理论知识，我还学到了许多做人的道理。通过解决各种各样的科研、生活问题，我的各方面能力均有了很大的提高。感谢我的导师刘会香副教授和何邦令副教授，两位导师在科研和生活上都给予了我很大的帮助，两位导师的谆谆教导和身体力行的示范都是激励我前行的动力，两位导师渊博的知识、严谨的治学态度、敏锐的观察力和勤勉的工作精神是我今后生活工作的榜样。同时还要感谢周成刚教授和刘振宇教授以及森林保护专业全体老师，他们在学习和生活上都给予了我很大的帮助。本研究能够顺利完成，离不开林业有害生物检定检测研究室全体同学的帮助和支持。感谢于成明师兄，他在实验技术方面给予了我许多帮助，在生活中我们也是好朋友好兄弟；同时感谢贾晓曼师妹，协助我完成了一部分的科研内容。感谢我的父母，他们的理解和体谅以及支持，是我坚持到今天的支柱，也将永远是我不断前进的动力。这是我在山东农业大学的第七个年头，如今即将离开，心里非常不舍，这里留下了我太多的欢喜忧愁。艾青的一句诗可以表达我现在感受，“为什么我的眼里常含泪水，因为我对这片土地爱的深沉”。孙庚午2016年夏57 苹果腐烂病菌转录因子VmSom1基因的克隆及功能分析攻读学位期间发表论文情况LiangChen,GengwuSun,ShujingWu,HuixiangLiu,HongkaiWang.EfficienttransformationandexpressionofgfpgeneinValsamalivar.mali[J].WorldJMicrobiolBiotechnol.2015,31:227-235H.X.Liu,W.P.Tan,G.W.Sun,Y.T.Zhao,B.L.He,andX.P.Zhu.FirstReportofGummosisDiseaseofApricot(Prunusarmeniaca)CausedbyBotryosphaeriaobtusainChina[J].PlantDisease.2015,99(6):888陈亮,孙庚午,王洪凯,吴树敬,林福呈,刘会香.葡萄座腔菌原生质体的制备及gfp的转化[J].林业科学.2014,50(6):131-137陈亮,伦莹莹,孙庚午,赵迎彤,何邦令,王洪凯,刘会香.苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化[J].山东农业科学.2014,46(8):109-112赵迎彤,孙庚午,郑伟,何邦令,薛明,刘会香.金银花维管条纹枯萎病研究初报[A].2014年中国植物保护学会学术年会论文集[C].201458