黄芪对糖尿病肾病大鼠肾间质wntβ-catenin信号通路及tgf-β1表达的影响

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分类号：R692密级：单位代码：10114学号t200910010黄芪对糖尿病肾病大鼠肾间质Wnt／13-catenin信号通路及TGF．13l表达的影响研究生：邪文超指导教师：左敬爱教援申请学位门类级别：专业名称：研究方向：所在学院：医学硕士内科学糖尿病肾病第一临床医学院2011年3月15日 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：7．交回学校授予的学位证书；8．学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名∥签灶日期：也2年』月￡同学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：指导教师签名：f1肌钞^年／月厂同F1期：丝臣年上月￡同(本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用) 目录主要缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IIABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。III—1上．—JL．H盯舌．⋯⋯．。。。．。⋯⋯。。．。⋯⋯⋯⋯。．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯．．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．24参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。27个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30 Lll西医科人学硕I二学位论文英文缩写ADPKDAMARBBUNCDNADNECMEMTESRDFQ-PCRHGFLEFMMTVPBSRCCScrSTZTCFTGF．13lUU0主要缩略词表英文译名中文全称Autosomaldominantpolycystic常染色体显性遗传性多kidneydiseaseAtragalusmongholicusAngiotensinIItypeIreceptorblockerbloodurinenitrogen囊肾黄芪血管紧张素III型受体抗剂血尿素氮complementDNA互补脱氧核糖核酸Diabeticnephropathy糖尿病肾病Extracellularmatrix细胞外基质epithelial．mesenchymaltransition上皮细胞转分化End-stagerenaldisease终末期肾病realtimefluorescencequantitative实时荧光定量一多聚酶链polymersechainreactionHepatocytegrowthfactor反应肝细胞生长因子lymphoidenhancerbindingfactor淋巴细胞增强子结合因子mousemammarytumorvirus小鼠乳头状瘤病毒phosphatebufferedsalineRenalcellcancerSerumcreatinineStreptozocinTcellfactor磷酸盐缓冲液肾细胞癌血肌酐链尿佐菌素T细胞因子Transforminggrowthfactor—B转化生长因子BIUnilateralureteralobstruction单侧输尿管梗阻肾病 山西医科大学硕!f：学位．睑文黄芪对糖尿病肾病大鼠肾间质Wnt／13．catenin及TGF．13】信号通路表达的影响中文捅要目的观察黄芪(Atragalusmongholicus，AM)对糖尿病肾病(Diabeticnephropathy，DN)大鼠肾间质中W州B．catenin信号通路及转化生长因子．131(Transforminggrowthfactor-13，TGF．131)表达情况的影响，探讨其抗糖尿病肾病肾间质纤维化的作用机制。方法采用单次空腹腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)60mg／kg制备糖尿病大鼠模型。4周后测定24h尿蛋白排泄量，以24h尿蛋白定量，>30mg确定DN大鼠模型成功(n=48)。48只DN大鼠随机分为4组：DN模型组(DN组)、黄芪治疗组(DA组)、DN模型组+氯沙坦治疗组(DL组)、DN模型组+黄芪联合氯沙坦治疗组(AL组)，每组12只。选取12只健康雄性wistar大鼠作为正常对照组(N组)。第4、8、12周末，收集尿液，检测24h尿蛋白定量。连续给药12周后，记录大鼠体重，并检测血清尿素氮(bloodurinenitrogen，BUN)、肌酐(Serumcreatinine，Scr)：处死大鼠，留取肾组织行HE及Masson染色观察肾间质病理改变，采用免疫组织化学技术及实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativechainreaction，FQ．PCR)检测肾间质中Wnt4、B．catenin及TGF一13l蛋白及mRNA的表达。结果与N组比较，12周术DN组、DA组、DL组和AL组大鼠24h尿蛋白定量、血清BUN、Scr明显增高，差异有统计学意义(胗O．05)。DA组、DL组和AL组作两两比较，AL组24h尿蛋白定量、血清BUN、Scr表达量下降更为明显，差异有统计学意义(尸O．05)。Wnt4、0．catenin及TGF—Bl蛋白在肾问质及肾小管上皮细胞内仅有微量表达。与N组比较，12周未DN组、DA组、DL组和AL组肾间质Wnt4、13．catenin及TGF．13l蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0．05)。DA组、DL组和AL组作两两比较，AL组Wnt4、13．catenin及TGF．13l蛋白表达量下降更为明显，差异有统计学意义(尸<0．05)。DA组与DL组相比各指标表达量差异无统计学意义(胗0．05)。FQ—PCR结果显示Wnt4、13一catenin和TGF—pmRNA在各组大鼠肾组织中的表达与Wnt4、B．catenin及TGF—p．蛋白表达趋势一致。结论黄芪可以降低24h尿蛋白定量，减轻肾问质病理损伤，下调Wnt4、13一catenin及TGF一13l在肾IhJ质中的表达，提示黄芪可能通过下调Wnt4、13一catenin及TGF一13l在肾I刨质中的表达，延缓DN大鼠肾问质纤维化的进程，而发挥。肾脏保护作用。关键词糖尿病肾病，黄芪，氯沙坦，Wnt／J3．catenin信号途径，TGF．13l 山阴医科大学硕士学位论文EffectofAtragalusMongholicusWnt／B—cateninandTGF—PISignalingPathwayExpressionintheRenalInterstitialofDiabeticNephropathyRatsAbstractPurposeToinvestigatethepossiblemechanismforatragalusmongholicustoprotectrenalfunction，theexpressionofWnt／13-cateninsignalingpathwayandTGF-131wereanalysedinSTZ．inducedofdiabeticmodel．MethodsThediabetesgroupratswereinducedbyinjectionintra-peritoneallywith60mg／kgbodyweightSTZin0．1mol／Lsodiumcitratesolution(pH4．3)．TheratsinNgroupwereinjectedwith0．1mol／Lsodiumcitratesolution．Diabeticmodelwasconsideredtobesuccessfulwhen24．hoururinaryproteinwashigherthan30mgafter4weeksoftheinjection(n248)．Aftermodelestablishment，Theseratswererandomlydividedinto4groups：DNgroup(n212)，DAgroup(n=12)，DLgroup(n=12)andALgroup(n212)．Meanwhile，12ratswereselectedtonormalgroup．12weekslater，bodyweight，bloodglucose，24·hoursurineproteinquantityandthelevelofserumcreatinine，ureanitrogenweremeasured，andthenalltheratsweresacrificedrespectively．Themethodsofimmunohistochemistryandreal—timefluorescencequantitativePCRwereusedtodetecttheexpressionofWnt4、13-cateninandTGF一13,inrenalinterstitial．Results24-hoururinaryprotein，serumcreatineandbloodureanitrogenweresignificantlyhigherthanthoseofthenormalcontrolgroups(P<0．05)．InDAgroup，DLgroupandALgroupweredistinctivelylowerthanDNgroup(P<0．05)．Innormalcontrolgroup，Wnt4，13-cateninandTGF·Dlexpressionwasweaklypositive．At12thweeks，inDNgroup，theexpressionofwnt4，13-cateninandTGF—plwasrelativelyincreased(P<0．05)．Inthreetreatmentgroup，theexpressionofWnt4、13-cateninandTGF—plwerereduced(P<0．05)．ALgroupwaslowerthantheothertwo，whileDAgroupandDLgrouphavenosignificantlydifference．ThemRNAexpressionlevelsofWnt4，13-cateninandTGF-13,indiabeticnephropathygroupwasincreasedwhencomparedwithcontrolgroup(P，／30mg确定DN大鼠模型成功(n=48)。48岁IDN火鼠随机分为4组：DN模型组(DN组)12只、黄芪治疗组(DA组)、DN模型组+氯沙坦治疗组 山西医科大学硕士学位论文(DL组)、DN模型组+黄芪联合氯沙坦治疗组(AL组)，每组12只。同时选取12只健康雄性wistar大鼠作为正常对照组(N组)。DA组每日灌胃黄芪水煎剂3ml(相当于生药2．1g)，DL组每日灌胃氯沙坦3ml(30mg·kg-I-d。1)，AL组每日灌胃黄芪+氯沙坦混合液3ml，DN组和N组每日予同等体积的蒸馏水灌胃，连续给药12周。实验期间所有大鼠均自由进食、饮水，为避免外源药物的影响，所有大鼠均不使用胰岛素或降糖药物治疗。2．3检测指标2．3．1大鼠的一般状况每日观察大鼠的精神状态、毛色、活动、摄食水量、尿量等一般状况。腹腔注射STZ或溶剂后的第3天起，分别于第2周、4周、6周、8周、10周、12周末测定大鼠体重。2．3．2血糖腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功同)起，每周末断尾取血测定血糖，不符合成模标准者弃去。2．3．324h尿蛋白定量腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功Ft)起，分别于实验的第4周、8周、12周术，将大鼠放入洗净的金属代谢笼(山西医科大学动物实验中心)内，收集24h的尿液，留尿期问禁食，不禁水，记录尿量，充分混匀后留取4-6ml尿液，于清洁干燥试管中离心后留取上清液。采用双缩脲法测定24h尿蛋白。2．3．4BUN、Scr腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功同)起，于实验的第12周木，处死各组大鼠。处死前抽取心脏血4ml左右，在常温下放置1h，4。C冰箱存放6h后，2000r／min离心10min，分离血清，一20℃冰箱冻存。采用Scr、BUN采用全自动多功能生化分析仪进行测定。2．3．5常规肾脏病理学观察腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功日)起，12周术取血后，迅速分离左肾，剥离肾包膜，白肾门处纵向切月：，饱和苦味酸溶液固定，石蜡包埋，常规切片，行HE染色及光镜观察。饱和苦味酸的配筲方法：过滤饱和苦味酸750ml，随后依次加入40％甲醛250ml和冰乙酸50ml，并充分混合，4。C冰箱冻存备用。4 山阴医科大学硕h学位论文肾间质HE染色方法：(1)饱和苦味酸中固定大鼠肾组织，石蜡包埋，常规理切片4lma；(2)常规脱蜡至水，蒸馏水3min；(3)苏木素染色6min30s；(4)浸入自来水洗掉多余的染液；(5)1％盐酸酒精3s；(6)自来水充分洗涤；(7)1％氨水中3S，返蓝；(8)自来水及蒸馏水冲洗；(9)伊红染色40S，晾干；(10)无水乙醇脱水二甲苯透明，中性树脂封片，最后在显微镜下观察。肾间质Masson染色方法：(1)饱和苦味酸中固定大鼠肾组织，石蜡包埋，常规理切片4p．m；(2)常规脱蜡至水，蒸馏水3min；(3)天青石蓝染色7min30S，自来水冲沈5min；(4)苏木素液染色6min，自来水冲洗5min；(5)1％丽春红和2％酸性品红以1：2比例充分混合，覆盖于肾组织上16min，甩去多余染液，擦干周边染液：(6)1％磷钼酸45S，甩去多余染液，擦干周边染液：(7)0．5％冰醋酸30S，甩去多余染液，擦干周边染液；(8)滴加亮绿8min，甩去多余染液，擦干周边染液；(9)1％磷钼酸45S，甩去切片表面多余染液，擦干周边染液；(10)O．5％冰醋酸30S，晾干后显微镜下观察。结果判定：光镜下观察，细胞核为蓝色，胞质及红细胞为红色，胶原纤维为绿色，问质纤维化定量分析采用ImageProp]us多媒体彩色病理图像分析软件。根据文献描述方法m3计算肾间质相对面积。2．3．6免疫组化检测腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功同)起，12周术取血后，迅速分离左。肾，剥离肾包膜，自‘肾门处纵向切丌，饱和苦味酸溶液固定，石蜡包埋，常规切片，采用SP法检测DN大鼠肾问质中Wnt4、t3．catenin及TGF—pl的表达量。免疫组化方法检测：(1)饱和苦味酸中固定大鼠肾组织，石蜡包埋，常规理切片2p．m；(2)常规脱蜡至水，蒸馏水3min；(3)0．01mol／LPBS液洗片4min×3次； LlJ西医科人学硕上学位论文(4．)在高温高压条件下使用枸橼酸缓冲液进行Win4抗原修复1min(13-catenin及TGF一13l采用EDTA溶液高温高压修复lmin)，冰水冷却20min左右，恢复至常温；(5)0．01mol／LPBS液洗片4min×3次：(6)滴加山羊封闭血清(以盖住组织表面为宜)，室温下孵育20min；(7．)0．01mol／LPBS液洗片3minx3次；(8)滴加75ul一抗滴加兔抗大鼠Wnt4多克隆抗体(1：300)、0一catenin(1：100)、TGF一13l(1：150)，同时滴加PBS液替代一抗作为阴性对照，然后放入4"C冰箱中过夜；(9)14h后，于4℃冰箱中取出切片，PBS液洗片4minX3次；flO)滴加试剂B至完全覆盖肾组织，37℃恒温箱孵育18min；(11)0．01mol／LPBS液洗片4min×3次；(14)新鲜配制的DAB液(1：1000)进行显色(须避光)，显微镜下观察控制显色程度(时间一般为3min左右)，待组织轮廓清晰且出现棕黄色颗粒后，最后用自来水终止显色；(15)苏木素复染1分40S，盐酸酒精分化2S，氨水返蓝；(16)无水乙醇脱水二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察，阳性着色为棕黄色颗粒。图像半定量分析：400倍显微镜下观察，每组随机选取10个不含肾小球和动脉的。肾小管问质视野。采用Image．ProPlusVersion6．0图像分析软件分析各视野下阳性目标光密度和阳性面积百分比，用平均光密度(IOD／area)代表指标表达量。2．4实时荧光定量PCR法检测腹腔注射STZ或溶剂后的第3天(即确定造模成功同)起，12周末取血后，迅速分离左肾，剥离肾包膜，放入液氮罐中，转移至山西医科大学第一医院病理科．80℃冰箱中冻存待用。(1)总RNA提取1)在冰台上分离各组大鼠肾皮质，取肾问质50mg，加入1mlTrizol，超声匀浆；2)加入200ul氯仿后，于旋涡混合器上剧烈振荡混匀30S，4℃12000r／min离心5min；3)移上清液至另一EP管，并加入相同体积异丙醇，在室温下放置5min并充分混匀，12000r／min离心5min；4)弃去上清层，沉淀RNA用70％乙醇lml洗涤沉淀2次，4℃12000rpm离心2min，EP管底部可得RNA沉淀，用50ul0．1％DEPC水溶解后可作为反转录的模板。(2)RNA逆转录成cDNA总RNA5ug(或1|Jg)，65℃孵育5min后快速离心，置于冰上，然后加入以下反应体系：11ulRNA1ug，随机引物(0．2ug／m1)lul，5×Buffer4tal，dNTP(10mmol／L)3“1，RNA酶抑制剂(20U／ta1)lIjJ及逆转录酶(20U／u1)l“l，并加入加Nuclease．Free到20Ill，25℃孵育10min，42℃9呼育1h，72℃孵育15min。6 (3)实时荧光定量PCR以反转录所得的eDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。所用弓物及扩增片段长度见表l。表1Wnt4、13．catenin及TGF-13l基因引物引物均由上海生工生物工程有限公司。目的基因与内参同管扩增。PCR扩增反应体系如下：cDNA2lal上游引物(15uM)0．5ul下游引物(15uM)O．5ulFastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)10lal无DNAse和RNAse的水7ul反应体系共20ul扩增条件为：94℃预变性10min，活化Tag酶；94℃15S，60。C60S，45个循环结束。荧光定量PCR读取CT(cyclethreshold)值，首先计算各样本测定基因XCT与内对照基因Beta．actinCT的差值，即ACT=CT(X)．CT(beta．actin)，再用各实验组样本的ACT减去『F常对照组样本的ACT，得到△ACT，利用2．△ACT进行计算，表示实验组测定基因X的表达相对与讵常对照组样本X表达的变化倍数。3统计学方法所有统计学分析均采用SPSSl7．0统计软件完成。所有数据均以均数±标准差表示。两组问差异采用LSD．，检验，两干预因素效应分析采用析因分析，各指标见相关性分析采用Pearson法。以P<0．05为差异有统计学意义。 山西医科大学硕士学位论文结果三口≯Rl大鼠一般状况N组大鼠摄食水量、尿量均正常，精神状态好，活动敏捷，且在整个实验过程中无明显改变。糖尿病模型制备成功后各实验组大鼠出现进食及饮水量增多，尿量增多，伴随体重下降；4周时上述症状加重，尿量明显增多，腥臭味加重；8周时，实验组大鼠毛色粗糙暗淡，活动差，摄食水量减少，体重减轻；12周时，DN组大鼠毛色粗糙暗淡，活动差，精神萎靡、活动迟缓，饮食量明显减少，体重明显减少，偶见腹部膨隆，足尖及尾尖水肿、破溃甚至坏死。DA组、DL组和AL组精神状况、活动情况及饮食量较DN组有所改善，尿液酮臭味略减轻．。224h尿蛋白定量4周末，与N组相比，DN组大鼠24h尿蛋白定量明显增高，差异有统计学意义(P<0．05)，经黄芪和(或)氯沙坦治疗4周后，DA组、DL组和AL组与DN组相比24h尿蛋白定量差异无统计学意义(舢．05)；并且随着病程进展呈进行性升高趋势，8、12周末，与N组相比，DN组大鼠24h尿蛋白显著增高(P<0．05)。经黄芪和(或)氯沙坦钾治疗12周后，DA组、DL组和AL组24h尿蛋白定量与DN组相比明显下降，差异有统计学意义(p<0．05)。三药物干预组作两两比较，AL组与DA组和DL组24h尿蛋白定量下降更为明显，差异有统计学意义(p∞．05)，而DA组与DL组相比差异无统计学意义(D帕．05)。见表1，图l。t周凋I碉注：与N组比较，’舢．05；与喇组相比，▲触．05图1各组大鼠24h尿蛋白定量的变化3BUN、Set12周末，与N组比较，DN组、DA组、DL组和AL组大鼠血清肌酐、尿素氮明显8∞绷∞o，●l1同斟口问圳嘲—日 山西医科大学硕上学位论文增高，差异有统计学意义(P0．05；与DN组相比，‘／K0．054肾脏形态学改变4．1HE染色HE染色显示，N组大鼠肾小管上皮细胞呈方形，排列整齐，大小一致，基底膜完整，肾小管及小管问质区结构清晰，皮髓质分界清楚，间质区未见增宽及炎细胞浸润。12周末，DN组肾小管萎缩，部分管腔扩张，排列较为稀疏，问质区明显增宽，肾小管上皮细胞脱落，伴有轻度水肿及炎性细胞浸润，同时可见少量丝状纤维组织沉积。DL组、DA组和AL组大鼠仅少数。肾小管扩张，上皮细胞水肿不同程度减轻，丝状纤维组织沉积较前较少。见图2。4．2Masson染色Masson染色显示，12周未，各组大鼠肾问质胶原相对面积(Masson染色肾问质绿染面积与视野绿染总面积的比值，％)分别为0．71±O．27、47．28±2．44、33．12±3．29、34．50±3．30、26．97±I．65。N组大鼠问质区仅可见极少量绿染；与N组相比，DN组、DA组、DL组和AL组。肾|’白J质胶原相对面积明显增加，差异有统计学意义(P<0．05)；经黄芪和(或)氯沙坦治疗12周后，DA组、DL组和AL组大鼠较DN组肾问质胶原相对面积明显减少，差异有统计学意义(P<0．05)；三药物干预组作两两比较，AL组肾问质胶原相对面积减少更为明显，差异有统计学意义(P<0．05)，而DA组与DL组相比差异无统计学意义(19>0．05)。见图3，4。9 山西医科大学硕士学位论文12周N组i-》·-爱≮≤蕊：j．二一一一o．◆!，：～◆慧簇辩蚤．箩i—12周DN组12周DA组一≯‘：t蛰Z?：×≯：’l?：o．o．‘V}o，．’／12周DL组12周AL组图2大鼠肾脏的病理变化(BEE染色，×4帅)出▲g姐’T．L口嘲口衄}▲●nD咀-蛆L▲图3各组大鼠肾间质胶原相对面积43各组大鼠肾间质Wnt4、B-catenin及TGF-B1蛋白的表达43．1各组大鼠肾间质Wnt4、B-eatenin及TGF-B1蛋白的表达N组Wnt4在肾小管上皮及肾间质细胞的胞浆处有微弱表达；与正常对照组比较，DN组、DA组、DL组和AL组Wnt4在肾小管上皮及肾间质细胞的胞浆处表达明显增强，差异有统计学意义(尸>0．05)。见图5。N组B-eatenin在肾小管上皮细胞基底侧有微弱表达；与正常对照组比较，DN组、10j■000l||j．100＼_卜÷。。。||弋¨o、1。j‘j||j¨。jjj。一I■。|_j一_㈢懿i{||-‘。00≯■∞羽m0^弭)娶旧莨罂唾垡峰厘堕 山西医科大学硕士学位论文DA组、DL组和AL组13-catenin肾小管上皮细胞的胞浆处表达明显增强，差异有统计学意义(尸>0．05)。见图6。N组TGF．Bl在肾小管上皮细胞胞膜处有微弱表达，DN组、DA组、DL组和AL组TGF．Bl在肾小管上皮细胞的胞浆处表达量明显增强，差异有统计学意义(砌．05)。见图7。三药物干预组作两两比较，AL组Wnt4、B-catenin及TGF．13l在肾间质中的表达减弱更为明显，差异有统计学意义(砌．05)，而DA组与DL组相比差异无统计学意义(尸>0．05)。见表2，图8。4．3．2黄芪和氯沙坦两干预因素的析因分析析因分析结果显示：在对DN大鼠肾间质Wnt4、13．catenin及TGF．13l的蛋白表达的抑制作用中，黄芪和氯沙坦两种干预因素之间存在交互效应(Fwnt4=4．240，Pwnt4=O．045<0．05；F口哪印in；4．179，P13c珊∞iIl=0．047<0．05；FTOF．p1=79．921，尸1'GF．Bl=0．002<0．05)，即黄芪与氯沙坦联合治疗对DN大鼠肾间质Wnt4、B-catenin及TGF-Bl蛋白表达的抑制作用最为明显。见图9。≯二◇。?一’誓。√r：滏渊擞≯疑12周N组12周DN组12周DA组k．◆≯、●r，．，●。。12周DL组12周AL组图5大鼠肾间质中Wnt4的表达(X400)j-¨一．^一．II。矿▲算盘t■一●生㈠．6．．■．_，o．糯站一^乒一一q．r一．一嫡譬噜．漾群¨慧 问漆；终毫辩疆◇3一12周N组12周DN组12周DAIS．12周DLJ目．12周AL组图6大鼠肾间质中B枷in的表达(×枷)乳≮蕊飞蔼皋r筻警’。：‘专≥l双．黪奢：，，弋。÷；。i，’『擎冈卜硝∥r12周N组_爨0划．销◆-．●参链I；’叠I▲y襞。{，，，◆．。●，’?j攒蕊蠢噍’．0灞I境”I．辩爻莹‘鼙如12周DNJ虽．12周DA组12周DL12周AL组图7大鼠肾间质中TGF-1]l的表达(×4∞)12一纂嘭，◆i!!；搿燮轰．譬辅篡∥螺小扩一 山蕊医科大学硬士学位论文囊2备组大■膏问质中wt“、B哪锄妯及TGF-1叠白的寰达(j±s)组别刀TGF．B。N组121．10±0．27▲2．58±0．48▲6．69±3．62-DA组1025．19±7．41"▲16．88±6．45*▲1037±3．06·-DL组1125．粥±8．10"▲17．12±6．42．I10．30±2．93·-AL组ll21．07±7．13"▲14．26±5．29．-9．09±2．03·-DN组937．10±8．08*25．05±9．83*18．94±7．56·注：与N组比较，·尸>0．05；与DN组相比，▲P<0．055040】璺越30钓萤20睁100Wnt4马一cateninTGF一置1注：与N组比较，叩>o．05；与DN组相比，▲Po．05)，。见表3，图12-15。14●‘_●T王Il三●‘差，暑暑-譬m 山西医科大学硕士学位论文一—_—-_—_--_--●-_-_———__—-_-——-_——-●-_-—____——_一圈lO大鼠肾组织WmHmRNA的表达’B,．csteuimmRNA溶解度曲线9．,,cateu虹mRNA扩增曲线图n大鼠肾组织9．．cstemimmRNA的表达图12大鼠肾组织TGF-PlmRNA的表达15 山西医科大学硕士学位论文襄4备组大■膏组织Wat4、9-tateala及TGF-ItImRNA的囊达(j±s)组别一Wnt4B-cateninTGF-8lN组1218．97-1-0．87▲13．36±3．24▲23．41±1．91-DA组1237．79±O．98‘▲36．68+_4．78’▲45．61±3．22*▲DL组1238．32_+3．01“35．39+_3．89“43．65_+2．78*▲AL组1229．87±2．痧▲29．20±1．33“40．90+_2．76*▲DN组1245．13±1．29’64．17_+4．64’77．95±5．37·注：与N组比较，·P加．05；与DN组相比，。套妯．05釉“p—cat∞iJl1疆r-p1注：与N组比较，·P加．05；与DN组相比，▲P<0．05●圈13各组大鼠肾组织Wn¨、9-tateala及TGF-PlmRNA的表达量暖∞∞伯∞∞∞∞∞∞0叫蝈样vN髻 山西医科大学硕士学位论文讨论糖尿病肾病作为糖尿病最常见微血管并发症危害极大，现已成为我国终末期肾病(End．stagerenaldisease．ESRD)的主要病因之一。其主要的病理特征为肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、肾小管基底膜增厚、管腔扩张，肾小管上皮细胞变性、细胞外基质积聚，随病程进展，可逐渐发展为肾小管萎缩及肾间质纤维化，最终可发展成为不可逆性肾脏组织结构损伤。DN的确切发病机制至今尚未完全阐明，目前认为其可能与糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学异常、氧化应激、多元醇通路及蛋白激酶C等激活、血管活性物质、环境及遗传因素等多种因素有关⋯。过去对糖尿病肾病的研究主要集中于肾小球病变方面，然而近来越来越多的研究证据表明，肾小管问质病变在发病时间上和发病机制上都具有一定的独立性。肾小管间质纤维化是指由多种因素导致的ECM在肾间质的过度沉积，其典型病理改变是肾小管上皮细胞变性、萎缩、消失及肾问质内炎性细胞浸润和细胞外基质大量积聚。研究证据显示，与。肾小球病变程度相比，。肾小管间质病变严重程度与糖尿病肾病肾功进展的关系更为密切。换言之，它是判断DN疾病预后及肾功能下降水平的重要指标之一12J。因此，进一步探讨DN肾小管问质纤维化的发生机制，以寻求新的特异性治疗靶点和有效的防治措施，具有极为重要的临床意义。肾脏纤维化的治疗大多数尚处于实验研究阶段，临床研究资料较少，主要是针对促纤维化因子及抑制ECM成分合成或促进其降解。中药可通过多靶点发挥疗效，近年来已有大量临床及实验研究发现许多种中药材有确切的抗糖尿病。肾间质纤维化的作用。本课题组长期致力于益。肾胶囊对肾脏保护作用机制的研究，并己发表了多篇相关论文。益肾胶囊为纯中药制剂，主要由黄芪(159)、当归(109)、芡实(159)、泽泻(109)、红景天(59)等成分组成，具有活血化瘀、清热化湿、滋阴益。肾等功效，尤其对糖尿病肾病有独特疗效。而处方当中君药黄芪更具有益气养元、扶『F祛邪、生血行血、利水消肿之功效，用于治疗糖尿病和各种肾脏疾病的有效性在长期临床实践中得以证实。前期研究表明ll引，黄芪可通过抗过氧化、改善‘肾小球滤过屏障、调节机体免疫力以及特异性阻断JAK／STAT等促纤维化通路来抑制FN和colI聚积，减少尿蛋白、降低血糖，从而延缓肾功能进展。肖敏【llJ等人采用UUO大鼠模型证实黄芪可通过促进HGF／c—met系统表达来抑制TGF一13I诱导的肾小管上皮细胞转分化。日i订国内对黄芪治疗糖尿病性肾损害的研究有很多，但其治疗作用机制尚需进一步研究阐明。ARB类药物被许多学者建议作为治疗DN的首选药物【liMJ。氯沙坦作为一种血管紧张素受体拈抗剂已被证实具有肾脏作用，不仅可以不依赖与血压下降而逆转DN肾小球高滤过，还可以降低DN患者的微量白蛋白尿。研究表明115]，ARB类药物町通过抑制GSK一3B及TGF．Bl的活性抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化过程从而发挥肾脏保{ff’'fi户lj。闪此，本研究选J扫氯沙坦1161为阳性对照药，来探讨黄芪抗糖尿病性肾问质纤维化的分子机制。 西医科人学硕i：学位论文本研究采用wistar大鼠作为研究对象，通过单次腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病模型，完全破坏胰岛13细胞功能，使胰岛素分泌缺失，形成胰岛素依赖性(1型)糖尿病。根据文献报道及前期研究对不同剂量造模效果的比较，选用60mg／kg的大剂量用量，成模率为100％，成模大鼠死亡率为6．25％，可认为该造模方法具有良好的重复性和可操作性。我们观察到DN大鼠在造模成功8、lO、12周时，24h尿蛋白定量明显高于对照组，且随病程延长有逐渐上升的趋势，提示8周时DN大鼠一出现明显病变。而血清肌酐、尿素氮水平在12周末明显高于对照组，Masson染色显示DN组、肾间质可见炎性细胞浸润、肾小管扩张或萎缩及大量纤维组织沉积，给予黄芪和(或氯沙坦)干预治疗12周后，24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮水平及肾间质胶原相对面积显著降低，但各药物干预组指标仍高于对照组(考虑可能与给药时间过短以及未采用综合治疗方案等因素有关)，提示黄芪和氯沙坦均可以降低尿蛋白，并通过减少大量蛋白尿对肾小管间质的刺激作用对糖尿病诱发的肾小管间质病变发挥保护作用。糖尿病性肾间质纤维化是在各种细胞因子、高糖微环境、慢性缺氧、终术糖基化产物及蛋白尿等因素综合作用下，导致。肾小管上皮细胞问充质细胞转分化、炎症细胞浸润、细胞外基质蛋白，如胶原(I、III、IV、V型)、Q—SMA、等的堆积而发生的【17】，其主要病理特征是问质成纤维细胞增生、。肾间质ECM积聚、肾问质炎性细胞浸润(以单核细胞为主)、肾小管萎缩消失等¨引。糖尿病性肾间质纤维化的发生机制至今尚未完全阐明，可能涉及多种细胞因子及信号通路，如结缔组织生长因子CTGF[19】等。体外实验表明【201，目自订公认的促纤维化因子TGF．6l在糖尿病性肾问质纤维化发生发展的多个环节中发挥重要作用【2¨。既往对实验性糖尿病肾病大鼠模型的研究发现，随病程推移TGF一13．蛋白表达量逐渐增高。我们推测，TGF一13。与高血糖所致的微循环障碍及其他多种生化异常等共同参与了DN肾纤维化进展15J。在对TGF．13l基因敲除小鼠模型的研究中，我们还发现肾小管上皮细胞中胶原、PAI一1和TIMP．1的表达量降低，抑制了肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质积聚，从而延缓。肾间质纤维化的发生1221。TGF．131首先结合胞膜上的TBR受体，从而使其磷酸化，并使细胞质内下游信号蛋白分子Smad2／3磷酸化，与胞浆内的Smad3结合形成低聚体复合物，最终将信号传递至细胞核内，通过对基因特异性转录因子LEFI／TCF的修饰对靶基因转录进行调控，使ECM合成增加，导致DN肾小管间质纤维化¨川。在本研究中，我们发现TGF—Bl蛋白在N组大鼠‘肾问质仅有微量表达，而在各实验组大鼠肾I训质中的表达量明显增高，经黄芪和(或)氯沙坦干预12周后，TGF—B，蛋白表达水平明显下降，且联合干预组(AL组)的治疗效果明显优于两单药干预组(DA组和DL组)。而TGF．BlmRNA的表达趋势与蛋白一致，提示我们黄芪和氯沙坦可能通过在转录水平下调TGF—Bl的表达水平而发挥其抗纤维化作用，而两药联合使用可产牛交互效应，使TGF—fjl的表达水平更为明显地降低。近来已证实，Wnt／p．catenin信号途径的异常活化不仪在急性肾小管损伤修复、多囊肾病及肾癌的发生发展起着重要作用【24‘2工261，并且与人体多个组织器官(如：肿、。肾及 LlJ幽医科大学硕}：学位论文皮肤)纤维化的进展密切相关【6,7,27】，同时有可能参与了糖尿病肾病肾间质纤维化过程峭j。B．catenin为该途径的核心分子。wm蛋白可抑制该通路下游糖原合成激酶-3B(GSK一313)的活性，GSK．313是13．catenin的胞浆内降解复合体成员之一，可使13一catenin泛素化后降解。当其受到抑制时，胞浆内13．catenin降解受阻，导致胞核内B—catenin水平升高，与基因特异性转录因子LEFl／TCF结合引起靶基因的转录，从而导致EMT的发生幽J。Surendran[‘7】等人在研究中发现单侧输尿管梗阻大鼠肾间质(Unilateralureteralobstruction，UUO)中该途径表达上调，而Wnt信号分子的拮抗剂DKKl可通过抑制UUO大鼠肾脏13一catenin的积聚，使胶原的产生减少，发挥其延缓肾问质纤维化的进展的作用，进一步证实Wnt／0一catenin信号途径的过度表达与糖尿病肾病肾间质纤维化过程存在相关性【8】。本研究发现，Wnt4蛋白在正常对照组大鼠肾间质有弱表达，在DN组。肾间质中表达均增高，经黄芪和(或)氯沙坦干预12周后，Win4、13．catenin蛋白表达水平明显下降；Wnt4、13．cateninmRNA与蛋白表达趋势一致，提示我们黄芪和氯沙坦可能通过在转录水平下调Wnt4及13一catenin的表达来发挥其抗纤维化作用。而两药联合使用可产生交互作用，使Wnt4、13．catenin的表达水平更为明显地降低。在本实验中我们还发现，Wnt4、B．catenin与。肾问质胶原相对面积、24h尿蛋白定量、血清BUN及Scr呈平行发展，且伴随TGF．13。表达增强。12周木DN大鼠肾小管问质中TGF．131表达量与Wnt4、B．catenin呈『F相关，提示Wnt／B-catenin信号通路及TGF-13。可能参与了糖尿病。肾病肾问质纤维化的发展。根据文献报道，TGF—B．可以直接或通过影响Wnt配体的产生间接调节Wnt／13一catenin信号途径的活化【29】。HoekeA【301等人采用siRNA技术沉默B—catenin蛋白表达，TGF．S，蛋白及核酸在肺组织表达量下调，而使用TGF．B．后，在患有或不患有慢性阻塞性肺疾病的个体肺问质均发现B—catenin的表达上调，进一步提示我们Wnt／13一catenin信号通路及TGF．B。可能存在交叉和对话(crosstalk)，并可能通过“crosstalk”相互作用共同促进了器官纤维化的发生与进展，如图14所示。由此推测在肾间质纤维化进程中TGF．B。和Wnt／B—catenin信号通路也可能存在相互作用关系，但其具体分子机制尚需进一步探究。19 山西医科大学硕士学位论文●_—————————————————————————————————————————————————————一图14Wnt／13．catenin信号途径与TGF-13l／Smad3信号途径之间的交叉示意图I∞I综上所述，在糖尿病性肾间质纤维化的过程中，W州t3．catenin信号通路和TGF．13．表达上调，且两者表达量呈一定程度的正相关。黄芪及氯沙坦的抗糖尿病肾间质纤维化及延缓肾功能进展的作用可能部分通过下调Win4、S．catenin及TGF．13。表达来发挥的，为其临床应用提供了新的理论及实验证据。而黄芪和氯沙坦联合使用，可产生交互效应而增强其抗纤维化作用，为DN的临床治疗提供指导。20 【IJpq医科人学硕士学位论文结论1．糖尿病肾病大鼠肾问质中W州13．catenin信号途径和TGF．131表达上调。2．黄芪可能通过下调Wnt／13．catenin信号通路及TGF．13。因子的表达水平，减轻肾间质损伤，延缓。肾功能进展，发挥一定的肾脏保护作用。 西医科人学硕一}j学位论文参考文献【1】高国丽，车光升，等．糖尿病。肾病发病机制的研究进展．中国老年学杂志，2007，11(27)：2254-2255【2]WangA，ZiyadehFN，LeeEYeta1．InterferencewithTGF—betasigningbySmad3knockoutinmicelimitsdiabeticglomeruloscleoscerosiswithoutaffectingalbuminuria．AmJPhysiolRenalPhisiol，2007，293(5)：1657-1665[3】YuHT．Progressionofthechronicrenalfailure．ArchIntemMed，2003，163(12)：1417-1429【4】余红梅，李雪锋．糖尿病肾病相关细胞因子研究进展．临床荟萃，2009，24(23)：2110—2“l[5】杨勤，谢汝佳，等．转化生长因子胞内信号蛋白Smad2／3在糖尿病大鼠肾脏表达的动态观察及意义研究．中国病理生理杂志，2006，22(10)：1879．1884【6]ChilosiM，PolettiV，ZamoA，eta1．Aberrantwnt／beta-cateninpathwayactivationinidiopathicpulmonaryfibrosis．AmJPathol，2003，162：1405—1502【7】SurendranK，McCaulSP,SimonTC．Aroleforwnt4inrenalfibrosis．AmJPhysiolRenaPhysiol，2002，282(3)：431-441[8】闰酷，段惠军，等．Wnt／13．catenin信号途径及ILK在糖尿病性肾小管问质纤维化发病中作用的研究【博士学位论文]．河北：河北医科大学，2009[9】CheonSS，NadesanP，PoonR，eta1．Growthfactorsregulatebeta—cateninmediatedTCF—dependenttranscriptionalactivationinfibroblastsduringtheproliferativephaseofwoundhealing．ExpCellRes，2004，293(4)：267-274[10】HoekeA，AnitaI．R．，GertruudHaitsma，eta1．Activationofwnt／B—cateninSignalinginpulmonaryFibroblastbyTGF一131IsIncreasedinChronicObstructivepulmonaryDisease．PlosOne，2011，6(9)：1—13【11】肖敏，樊均民．黄芪在肾脏疾病治疗中的作用机制．西部医学，2009，2l(3)：474—475[12]左川，谢席胜，邱红渝，等．黄芪对单侧输尿管梗阻大鼠肾『自J质纤维化的作用研究．现代预防医学，2008，35(4)：784．787[13]MatsuakaT，KatoriH，MiyazakiYela1．AngiotensinIIasaplayerinfibrosis．NephrolDialTransplant，2000，15(6)：64-65[14]Ruiz—OrtegaM，RuperezM，EstebanV，ela1．AngiotensinII：akeyfactorintheinflammatoryandfibroticresponseinkidneydiseases．NephrolDialTransplant，2006，21(1)：16—20[15]MauerM，ZinmanB，GardinerR，ela1．Renalandretinaleffectsofenalaprilandlosartanintype1diabetes．2009，361(1)：40—5l【16】KellnerD，ChenJ，RichardsonI，ela1．Angiotensionreceptorblockadedecreasesfibrosis22 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【啪§医科大学硕士学位论文综述wnt／13．catenin信号途径与在肾脏发病中的作用W州B．catenin信号途径在细胞的形态与功能分化、增殖、凋亡、机体免疫应激及胚胎发育等生理过程中发挥着重要作用，并且参与调控细胞癌变、肿瘤发生、器官纤维化等病理过程【11，已成为近年来分子生物学、细胞生物学和肿瘤学及器官纤维化的一大热点。近年来，关于W州13．catenin信号途径的研究报道大量出现，当中不乏有其参与后肾单位的发育、急性肾小管损伤、肾肿瘤、多囊肾、慢性肾脏病以及糖尿病肾病等疾病发生发展的研究报道【2,3,4,5】。现将W州13．catenin信号途径以及糖尿病肾病小管纤维化方面的研究现状做一综述。1Wnt／B．catenin信号途径1．1Wnt的发现、结构Wnt／13catenin信号途径是十分保守的信号转导通路，wnt家族成员从低等生物到高等哺乳动物具有高度同源性。最早，人们对Wnt基因的认识纯属偶然。20世纪70年代初，Shanna等人在关于果蝇胚胎发育的研究中发现无翅基因(wingless)。20世纪80年代初，Nusse等16J在用小鼠乳头状瘤病毒(mousemammarytumorvirus，MMTV)诱导小鼠产生乳腺癌的研究过程中发现，MMTV常常固定整合于小鼠染色体的特定位点，并激活该位点的基因，这一位点的基因因被命名Intl；随后的研究发现，该基因与果蝇胚胎发育基I因Wingless(Wg)同源，故将二者的名称合并后，将该基因重新命名为Wnt。目前已知人类的Wnt家族就至少有19种成员。除果蝇的wingless、wnt3／5Wnt4等大分子蛋白外，其余的Wnt蛋白均具有相似的结构17J。大多数Wnt蛋白大小约40kD，长度大约为350～400个氨基酸，起始为疏水氨基酸信号序列。其中含有带电残基及约23．25个物种间高度保守的半胱氨酸残基。部分半胱氨酸残基可形成分子间或分子内二硫键，从而参与Twnt的折叠及多聚化【8】。其后连接有信号肽酶识别位点，没有跨膜结构域，含有一段由23～24个半胱氨酸构成的基本恒定的信号区【9】。尽管Wnt一级序列中含有带电氨基酸残基，而小鼠wnt3A和果蝇wg却属于疏水蛋刨10，Il】，其疏水的特性有利于Wnt信号与细胞膜结合。1．2经典Wnt信号途径组成及其活化Wnt信号通路是一条高度保守的信号传导通路，从低等生物(如果蝇)至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源。11。Wnt基因属于原癌基因，产物为分泌型糖蛋白，含一段信号肽以及23或24个位置保守的半胱氨酸残基。通常认为，经典的Wnt信号传导通路的组成成分主要包括：配体(Wnt家族分子)、跨膜受体(Frizzled家族分子矛tlLRP5／6)、胞浆调节蛋白以及核内转录因子(TCF／LEFl家族)等D2l。经典Wnt信号途径可以概括为：Wnt蛋白与细胞膜上Fz受体及辅助受体LRP5／6结合一LRP5胞内区与体轴发育抑制因子相互作用一B—catenin降解复合体解离一fj—catein积累入核一!jTCF／LEF卡H互作用一激活靶基因转录(如c—myc、cyclinDl)一产生生物学效应1131。：在没有Wnt信号时，细胞质内0．catenin与Axin、结肠癌抑制因 J西医科大学硕士学位论文子(APC)、蛋白质磷酸酶2A(PP2A)、糖原合酶激酶313(GSK3b)以及t3一TrCP蛋白形成巨大复合物结合后被磷酸化，并且通过13一TrCP蛋白的泛肽化，进一步被蛋白酶体降解。Wnt蛋白与受体结合以某种方式激活Dvl蛋白，使它在基于Axi“APC／GSK313的13．catenin降解复合物中抑制了GSK313活性，从而抑制13．catenin被磷酸化后的泛肽化降解，导致13．catenin在胞质内稳定的累积。这种累积打破了细胞内原有的13．cmemn出入核平衡，使得细胞核内的13一catenin大大增加，与含有HMG．Box的转录因子LEFI／TCF家族成员结合。LEFl／TCF在没有与B．catenin结合时，能与转录抑制因子Groucho家族成员形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，TCF／LEFl与细胞核内的13．catenin结合，导致与Groucho的结合亲和力下降，从而解除抑制作用【13】。2．Wnt／B．catenin信号途径与后肾发育在肾脏发育过程中，wnt信号通路通过对胞浆B．catenin水平的调节对后肾的正常发育起重要作用。此外还可许多其他检测到、Vnt蛋白如：writ．2b、．4、．6、一7b、．9b、．1l在肾脏发育中表达，而以Wnt．4和Wnt一9b在肾小管发生的起始阶段最为重要。wnt．9b在输尿管芽中表达．对生后肾原基的甲．期诱导很重要。引起间充质细胞的聚集【14】。大量研究证据表明，Wnt／13·catenin信号途径诱导并参与了输尿管芽周围后肾间充质的形成及问充质细胞向肾小管上皮细胞的分化¨41。13．catenin基因缺失会导致输尿管芽分支形态缺陷以及严重的肾发育不良，但其过度表达又可拮抗集合管上皮细胞的终术分化【"】。因此，胞浆与胞核内的13一catenin水平的平衡状态可维持胚胎后肾的『F常发育和分化。3．wn“13一catenin信号途径与急性肾小管损伤修复UUO动物模型中，C型利钠肽(CNP)在。肾损伤后被激活，可通过wnt4以TCF／LEF依赖的方式发挥抗肾小球纤维化和系膜细胞增生【16】。在对大鼠急性肾缺血再灌注动物模型的研究中，Terada等人【2】发现造模成功后1hwnt4的mRNA和蛋白质表达水平均升高，伴随aquporin一1、GMl30、cyclinA和PCNA等在近端肾小管共表达。由此，我们可以推测wnt／B—catenin信号途径在急性肾损伤过程中可促J茳cyclinDl的表达，从而发挥‘／ifd,管损伤修复的作用。4．Wnt／13．catenin信号途径与肾脏纤维化Surendmn等117J制作大鼠小管问质性肾纤维化模型，发现wnt4在集合管中有表达并伴随集合管周围纤维化形成，问质成纤维细胞wnt4高水平表达与I型胶原及平滑肌激动蛋白的高表达一致；体外实验表明Wnt4可以诱导培养的成纤维细胞fj．catenin进入细胞核内。He等IJ驯分析了小鼠阻塞性。肾损伤后writ信号通路的受体和拮抗剂的表达，发现单侧输尿管梗阻后，除Pl-wnt5b、wnt8b矛Nwnt9b，其他所有wnt家族成员的表达均有上调。此外，大多数Fz受体蛋白和wnt拮抗剂均被诱导产生。阻塞性肾损伤导致13一catenin在细胞质和肾小管上皮细胞的细胞核急剧积累，表明wnt经典通路被激活。』毛JDDK基因治疗抑制肌成纤维细胞活化，抑制成纤维细胞表达的特异性蛋f7¨、I型胶原和纤维连接蛋白．减少了对梗阻性肾病模型的总胶原含量。并且与其他已知肾小管问质纤维化的信号通路也存在“串话”，如 l山西医科人学硕士学位论文TGF．131／Smad、MAPK、P13K／Akt等，共同作用导致肾脏纤维化的发生。5．Wnff13．catenin信号途径与多囊肾常染色体显性遗传病多囊肾(Autosomaldominantpolycystickidneydisease，ADPKD)是最常见的遗传性肾脏疾病之一，其形成多依赖于肾小管上皮细胞极性缺失及细胞间的信号传递减少。转基因小鼠中13．cmemn过表达可引起肾小管形成延迟，最终则可导致严重后果的多囊性病变【191。在肾发育早期阶段，W州13一catenin信号途径是必须的，而在晚期阶段，过度的13一catenin信号将促进囊的形成，提示Wnt／13．catenin信号途径表达异常可能参与了多囊肾的发生与发展【20】。6．Wnt／13．catenin信号途径与糖尿病肾病近来越来越多的研究表明糖尿病肾小管问质病变的严重程度与肾功能的进行性下降密切相关。已有研究表明高糖可诱导肾小管上皮细胞表型向间充质细胞转变，分泌并聚集细胞外基质而导致肾间质纤维化发生【211。Wnt信号通路的异常激活与肾、肺、肝、心脏以及皮肤等组织器官纤维化的发生与进展关系密切【22，23“J。已有研究表明W州B．catenin信号途径在糖尿病肾病早期以及高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程中表达增高，该途径可能参与了糖尿病肾病肾小管问质纤维化的发生和进展。9．Wnt／13．catenin信号通路与肾细胞癌肾细胞癌(Renalcellcancer，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。大量研究证据表明，VHL基因是重要的肿瘤抑制基因，它的缺失可以引起细胞信号转导机制异常，并最终导致肾细胞癌的发生发展【5】。研究还发现，13．catenin可能是肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)诱导的RCC发生是的细胞内信号介导者。由此可见，13．catenin可能会成为RCC的生物标记物之一以及药物治疗的重要靶点。综上所述，Wnt／B—catenin信号通路是一条多环节、多靶点的．丌放通路，既可在肾脏发育和急性肾小管损伤修复过程中发挥积极调控作用，又能够导致多种组织器官纤维化的发生发展。Wnt／13．catenin信号通路与诸多信号转导通路相互交叉形成错综复杂的信号网络，对整个细胞乃至及机体的生长、分化、发育中发挥其调控作用。目前，对wnt／B．catenin信号通路的各个环节及组分的研究，尤其是其核心分子B．catenin的作用研究可为肾脏病的多靶点治疗提供可能性，因而在分子生物学及干细胞生物学的研究中越来越显现出潜在价值。继续深入探讨Wnt／t3．catenin信号通路在各种肾脏疾病中的作用，以期发挥其积极调控作用，抑制其异常激活为肾脏病的治疗提供新的靶点及依据。26 IjI西医科人学硕l。学位沦文参考文献【l】FoddeR，BrabletzT．wnt／beta—cateninsignalingincancerstemnessandmalignantbehavior．CurrOpinCellBiol，2007，19：150-158【2】2TeradaYTanakaH，OkadoT’eta1．ExpressionandfunctionofthedevelopmentalgeneWnt．4duringexperimentalacuterenalfailureinrat．AmSocNephrol，2003，14：1223．1233【3]LoganCY，NusseR．TheWntsignalingpathwayindevelopmentanddisease．AnnuRevCellDevBiol，2004，20：781-810．【4】Saadi-KheddouciS，ErrelbiD，RomagnoloB，eta1．Earlydevelopmentofpolycystickidneydiseaseintransgenicmiceexpressinganactivatedmutantofthebeta-cateningene．Oncogene，2001，20：5972-5981[5】LinehanWM，WaltherMM，ZbarB．Thegeneticbasisofcancerofthekidney．Urol，2003，170(6)：2163-2172．[6】NusseR，VarmusHE．Manytumorsinducedbythemousemammarytumorviruscontainaprovirusintegratedinthesameregionofhostgenome．Cell，1982，31(1)：99-109【7]MillerJR．Thewnts．GenomeBiol，2002，3(1)：Review3001．1-3001．15【8]TanakaK，KitagawaY，KadowakiT．DrosophilasegmentpolaritygeneproductporcupinestimulatestheposttranslationalN—glycosylationofwinglessintheendoplasmicreticulum．BiolChem，2002，277(15)：12816—12823【9】韩萍萍，郑若男，等．wnt信号通路及其与疾病的关系．2009167(11)：13—15【10]WillertK，BrownJD，DanenbergE，eta1．wntproteinsarelipid—modifiedandcanactasstemcellgrowthfactors．Nature，2003，423(6938)：448-452[11】ZhaiL，ChaturvediD，CumberledgeS．Drosophilawrit-lundergoesahydrophobicmodificationandistargetedtolipidrafts，aprocessthatrequiresporcupine[J]．BiolChem，2004，279(32)：33220-33227【12】刘洋，张晨光，周春燕，等．经典Wnt／13一catenin信号通路中的双向调控j匕京大学学报，2010，42(2)：238-242．[13】HuangH，HeX．Wnt／B—cateninsignalingnew(andold)playersandnewinsights[J]．CurrOpinCellBiol，2008，20：119—125【14】MerkelCE，KarnerCM，CarrollTL．Molecularregulationofkidneydevelopmentistheanswerblowinginthewnt．PediatrNephrol，2007，22(11)：1825一1838[15]KamerCM，ChirumamillaR，AokiS，ela1．wnt一9bsignalingregulatesplanarcellpolarityandkidneytubulemorphogenesis．NatGenet，2009，41：793—799【16】SurendranK，SimonTC．CNPgeneexpressionisactivatedbyWntsignalingand27 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一、个人资料姓名：邓文超个人简介性别：女出生日期：1986年2月28日籍贯：山西临汾市政治面貌：团员专业：肾脏内科最后学历：医学硕士学位二、教育经历：民族：汉族英语水平：6级毕业学校：山西医科大学2004年一2008年山西医科大学汾阳学院本科2009年．至今山西医科大学硕士三、在校期间发表的论文：．黄芪对糖尿病肾病大鼠。肾问质Wnt／13-catenin信号通路及Smad3表达的影响29 IJ西医科人学硕【J学位沦文致谢本课题是在我的导师方敬爱教授的精心指导下完成的。课题构思、实验设计、实施以及论文撰写，无一不凝聚着导师的殷殷心血。值此论文完成之际，谨向我最尊敬的方老师致以最崇高的敬意及诚挚的感谢，感谢我的导师三年以来学习上孜孜不倦的教诲和生活中无微不至的关怀!恩师严谨求实的治学态度，兢兢业业的工作作风，精益求精的医疗技术和勇于突破的创新精神都深深的影响着我，将使我终生受益。衷心感谢山西医科大学第一附属医院肾内科全体老师，特别是张晓东老师、孙艳艳老师在实验设计、实施及论文完成过程中给予的帮助和在临床工作中给予的指导。感谢山西医科大学第一医院病理科梁建芳主任、肖红老师、高建忠老师、白瑞兵老师、万慧丽老师在免疫组化实验过程中给予的帮助和支持。同时感谢同门师姐常沁涛、李慧、王蕊花、范彦君及肾内科各位研究生同学在实验过程中不遗余力的合作和帮助。再次感谢所有支持和教导过我的你们，愿你们永远快乐、平安130