氧腈酶催化合成手性药物中间体的研究

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1、山东大学博士学位论文氧腈酶催化合成手性药物中间体的研究姓名：方方申请学位级别：博士专业：微生物与生化药学指导教师：吉爱国;孟昭力20081030山东大学博士学位论文摘要研究目的：手性Ⅱ．氰醇作为手性源可以衍生得到手性a．羟基酮、a．羟基酸酯、D．羟基胺和a．氨基腈等诸多重要的药用、农用和精细化工产品的手性中间体。以氧腈酶为生物催化剂立体选择性的催化合成手性Gt．氰醇，在形成新的C-C键的同时，产物的分子结构中也被引入了手性。本论文以多种来源的氧腈酶为生物催化剂，催化生成在药物合成中具有重要应用价值的手性a．氰醇的药用中间体；通过固定

2、化技术对不同选择性和不同结构的氧腈酶进行固定后使用，为氧腈酶的工业化应用打下基础；探索新的氧腈酶源，尤其是从微生物中筛选在植物中含量相对较少的§选择性的氧腈酶，扩大孓型氧腈酶的来源，以期在合成手性药物中间体时，具有廉价易得的孓型氧腈酶可利用。研究方法：1．本研究选取的底物分别为：苯乙醛、5．苯并噻吩甲醛、3，4一亚甲二氧基苯甲醛、3，4．亚甲二氧基苯乙醛和3，4．亚甲二氧基苯丙酮。通过化学法合成出相应的五种外消旋乙酰化Q一氰醇和一种由3，4．亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷反应生成的相应外消旋乙酰化p一硝基醇。以上述产物为标准品探索合适的

3、色谱条件，为准确分析生物转化产物的ee值奠定基础。2．在含有柠檬酸缓冲液的IPE反应体系中，以丙酮氰醇为HCN源，使用苦杏仁(砌HNL)、苹果、樱桃、枇杷和木瓜(oHI儿)五种R．选择性的氧腈酶和橡胶(册HNL)、木薯(心HNL)两种孓选择性的氧腈酶为生物催化剂，分别催化五种底物的手性羟腈化反应。以收率和ee值的高低为指标，比较具有相同选择性的氧腈酶转化以上底物的能力。3．以HbHNL为催化剂，催化3，4．亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷的缩合反应，分别考察有机溶剂的种类、缓冲溶液的浓度、pH值、缓冲溶液的百分含量和硝基甲烷的浓度对生物转

4、化的影响，确定该类生物转化反应的最佳反应条件。4．分别使用多醛基葡聚糖和EupergitC为固定化载体，与苹果氧腈酶共价结合后，得到相应的固定化酶。进行三因素七水平的均匀设计实验，研究不同条件下生成的多醛基葡聚糖对固定化酶活性的影响。探讨EupergitC与苹果氧腈酶山东大学博士学位论文结合时，缓冲溶液的pH值、浓度和EupergitC用量对固定化酶活性的影响。分别检测两种方法对苹果氧腈酶固定化的牢固程度。使用5．苯并噻吩甲醛为底物，以收率和ee值的大小为指标，对比固定化酶与游离酶在双相和微水相反应体系中的催化结果。探讨底物分别被固

5、定化苹果氧腈酶循环催化的情况。5．使用磁性微球对HbHNL进行固定化，检测HbHNL被固定化的牢固程度及放置时间对固定化酶活性的影响，探讨固定化酶被循环使用的次数，以3,4．亚甲二氧基苯甲醛为底物，以收率和ee值的大小为指标，对比固定化酶与游离酶在双相和微水相反应体系中的催化结果，探讨底物分别被磁性微球固定化HbHNL循环催化的情况。6．以外消旋2．(苯并噻吩．5．基)．2．羟基乙腈为HCN的供体，以3,4．亚甲二氧基苯甲醛为底物，在磁性微球固定化HbHNL催化下，尝试一次生物转化得到两种具有重要用途的手性a．氰醇。7．从反应体系p

6、H值、酶制剂的种类和用量、丙酮氰醇的用量等方面探讨3，4．亚甲二氧基苯丙酮被手性羟腈化时ee值低下的原因。8．以苯乙酮为底物，优化来源于木瓜氧腈酶(以前未见报道)的催化反应条件，探讨其催化一系列甲基酮底物手性羟腈化的能力。尝试使用多种植物组织粗粉为催化剂，以苯甲醛为转化底物，以期寻找到新的植物来源的氧腈酶。以多份土壤为待筛样品，以扁桃腈为唯一碳源，从中筛选仅产§型氧腈酶的微生物。结果：1．以ChiralcelOB—H(4．6×250mlTl，5gm)为手性固定相，以不同体积百分比的正己烷和异丙醇溶液为流动相，对五种外消旋乙酰化0【．

7、氰醇和一种乙酰化B．硝基醇进行了较好的分离。2．苹果氧腈酶催化五种底物生物转化的收率介于24—91％之间，催化生成尺．型产物的ee值介于41-97％之间。HbHNL催化五种底物生物转化的收率介于35—85％之间，催化生成孓型产物的ee值介于29—98％之间。3．在含柠檬酸缓冲液(40％V／V，0．2M，pH7．5)的MTBE溶液(10mL)中，当加入的HbHNL量为200gL，硝基甲烷与3，4．亚甲二氧基苯甲醛初始浓度分别为2．4M和O．3M时，20-250C反应24h后生物转化的收率为71％，ee值为2山东大学博士学位论文83％。

8、4．使用100kDa的葡聚糖、葡聚糖和高碘酸钠的用量分别为1．2g和1．8g、反应130min时制得的多醛基葡聚糖与1mL苹果氧腈酶粗提液反应，交联后的固定化酶与游离酶相比保留了53％的酶活。循环催化苯乙醛羟腈化反应10次也未见明显的