非洲猪瘟p54蛋白的表达及elisa抗体检测方法的建立

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1、万方数据StudiesontheExpressionofAfricanSwineFeverVirusp54ProteinandEstablishment0fELISAforDetectionofAntibodies’’、’‘submittedt01heslssubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy1●一一WangLi--ping(CollegeofAnimalScienceandVeterina

2、ryMedicine)Supervisor：Prof．QinXiao--bingervlsor：-ShanHuGongZhen-huaQingdao．ChinaJune，2014㈣幽万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：乇匍’时间：加l牛年歹月眵日关于

3、论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)黜张_功’帆训性阳传日导师签名：秀觋别z，时间：加f午年钿侈日万方数据壹鱼盘些太堂亟±堂僮途窒摘噩非洲猪瘟p54蛋白的表达及ELISA抗体检测方法的建立摘要非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswine

4、fevervirus，ASFV)弓l起的猪的一种急性、热性传染病，该病发病率高，死亡率从5％到100％不等，世界卫生组织将其列为必须要报告的动物疫病之一。自1921年ASF在肯尼亚首次发现以来，目前已在非洲、欧洲和美洲等约49个国家报道发生过ASF疫情。2007年，与我国接壤的俄罗斯爆发ASF，目前陆续有14个州爆发过ASF，若继续蔓延，我国不排除传入ASF的可能。ASF的蔓延速度非常快，仅最近1年，就有包括白俄罗斯、乌克兰、立陶宛在内的三个国家首次发现ASF。目前，各国都在建立ASFV的快速检测和监测方法以控制ASF的侵入，由于我国目前尚未发现此病

5、，而且国内禁止引进外来病毒，从国外引进血清又昂贵复杂，导致我国在此病的检测方法上明显落后于一些发达国家。因此，利用重组ASFV抗原建立快速、安全的诊断方法，以进行技术储备是十分必要的，对防止ASF传入我国具有重要意义。本研究旨在原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白，并进一步建立p54间接ELISA方法，用于ASFV的诊断。1．参考非洲猪瘟病毒Con09／Bzz020株p54基因(E183L)的核苷酸序列，通过序列优化后合成p54基因，克隆至表达载体pET-30c(+)，构建重组质粒pET-30c(+)一p54。结果显示，pET-30c(+)．p

6、54有完整的阅读框架，可表达分子量约21kDa的p54蛋白，该蛋白表达稳定，具有可溶性，易于纯化，纯度为95％，浓度高达800}tg／mL，所表达的p54蛋白的氨基酸序列与Con09／Bzz020株p54蛋白氨基酸序列相同；Western—blot试验显示，表达的p54蛋白能与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。研究结果证实p54蛋白表达产量高，易于纯化，具有较好的抗原性，可用于非洲猪瘟ELISA诊断。2．利用纯化的p54重组融合蛋白作为抗原，进行p54抗体检测间接ELISA方法的建立。对ELISA反应的条件进行了优化，确定抗原p54的包被浓度为1．

7、2599／mL；血清稀释度为1：50；最佳包被条件为37"Clh+4。C过夜；最适封闭液为5％的脱脂奶粉；标准阳性血清的最适结合时间为60rain；二抗最佳稀释度为1：1000；二抗最佳结合时间为30mm；底物最佳显色时间为15rain。包被的抗原与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒血清均无交叉反应，批内重复性试验结果的变异系数均值小于7％，批间重复性试验结果的变异系数均值小于10％，证实该方法具有很高的特异性和重复性。万方数据壹璺盛些太堂殛±堂位诠塞摘要关键词：非洲猪瘟病毒；p54蛋白；表达；纯化；间接ELISA万方数据壹岛盔些太堂

8、亟±堂僮论文丛签I基△翊：StudiesOiltheEfficientExpressionofAfrican