猪瘟抗体阻断elisa检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价

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1、r————————————————————一————⋯＼删嬲l本研究由中国兽医药品监察所承担的下列项目支持1．“十一五”国家科技支撑计划课题《猪瘟、猪伪狂犬病综合防控技术集成与示范》2006BAD06A182．“十一五"国家科技支撑计划课题《高通量鉴别诊断技术研究与应用》子课题《猪瘟疫苗毒与流行野毒鉴别诊断试剂盒研制》2006BAD06A123．“十一五力国家科技支撑计划课题《重大动物疫病病原遗传变异及分子进化规律研究》子课题《猪瘟病原遗传变异及分子进化规律研究》2006BAD06A034．农业部“引进国际先进农业科学技术竹项目合同书(滚动)

2、子课题“猪瘟抗原捕获ELISA试剂盒研制”一——1—1'■■●1●{11摘要IIII量皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼罡曼曼曼曼曼皇曼!曼曼鼍皇曼曼舅曼曼曼巴曼曼曼皇曼皇曼量曼曼鼍曼曼鼍皇曼曼曼曼薯本研究将含有编码猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的重组杆状病毒接种于SF9昆虫细胞中，经复壮和悬浮培养后收集细胞上清，过滤后用镍柱做亲和层析纯化E2蛋白，经SDS．PAGE鉴定，在约53Kda处有一特异表达的蛋白带，同猪瘟病毒E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印迹表明，该蛋白带能与猪瘟阳性血清发生特异反应。将猪瘟单克隆抗体WH303株的杂交瘤细胞

3、从液氮中取出复苏，培养增殖后接种于BALB／C小鼠腹腔，5天后收获含有单抗的腹水，并测定其效价。腹水处理后用ProteinG亲和层析纯化单克隆抗体，经SDS—PAGE鉴定后用过碘酸钠法进行标记，测定酶标抗体的浓度，并于．20℃冻存。以纯化的E2蛋白和制备的酶标单抗为基础，建立了猪瘟抗体阻断ELISA检测方法。通过对ELISA各反应条件的优化，确定了最佳反应条件：E2蛋白的最佳包被浓度为0．09ug／ml，最适包被条件为4"C16h；最佳封闭液为PBST+10％脱脂奶粉+Proclin300+5％海藻糖，封闭条件为4℃16h；最佳血清稀释液为P

4、BST+5％奶粉，稀释倍数为2倍，血清孵育时间为37。Clh：酶标单抗的最佳工作浓度为O．37ug／ml，最佳酶标单抗稀释液为PeroxidaseConjugateStabilizer，工作条件为25。C30min。采用优化好的ELISA反应条件，检测了猪瘟抗体血清盘，将OD值用ROC曲线法进行分析，得到本方法的阴阳血清判定值为：36％的抗体阻断率，检测灰区介于32％--40％的抗体阻断率之间。对建立的猪瘟抗体阻断ELISA法进行了性能评估，结果表明：本方法和常见的猪病毒抗体没有交叉反应；与IDEXX试剂盒相比较，其特异性和敏感性分别为：94

5、．2％和98％；用本方法检测“欧盟实验室质控品”，结果同IDEXX猪瘟抗体试剂盒的检测结果一致；用免疫猪的血清评估本方法，显示本方法和IDEXX试剂盒的相关性高于O．8。根据本方法的检测结果，对猪瘟弱毒疫苗的免疫剂量和免疫保护期进行了研究。用1200RID、6000RID和24000RID三种不同剂量的猪瘟弱毒活疫苗免疫30日龄断奶仔猪，检测其抗体水平的变化，并用猪瘟强毒感染试验猪，观察抗体对猪的保护。结果表明：不同组试验猪的抗体水平没有显著差异，接种疫苗后的前3个月，免疫猪的抗体水平迅速升高，70后天抗体水平趋于稳定，12个月后的猪瘟抗体仍

6、保持在很高的水平，且能完全抵御猪瘟石门强毒的攻击。关键词：猪瘟抗体、阻断ELISA、猪瘟疫苗的接种ThisresearchinoculatedtherecombinantbaculoviruswhichcontainthegeneofenvelopeglucoproteinE2ofcodingclassicalswainfevervirusintoSF9cellsofinsects．TopunfytheglucoproteinE2，Icollectedthecells’supematantafterrejuvenationanddropcul

7、true，andthenfiltratedthesupcTnatantandusedthenickelpillartodotheaffinitychromatography．AssayedbySDS—PAGE，thereisallidio·expressiveproteinlineat53KdawhichisalmostsamesizetoglucoproteinE2；WesternblotshowsthatthisproteinlineCanidio—reacttotheclassicalswinefeverpositiveserum．re

8、coveredhybfidomaeellofclassicalswinefevermonoclonalantibodyWH303fromliquidnitrogen