myostatin基因失活转基因绵羊的制备及表型初步分析

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1、分类号：密级：学号：2008208008单位代码：10759石河子大学博士学位论文Myostatin基因失活转基因绵羊的制备及表型初步分析学位申请人胡圣伟陈创夫教授指导教师乔军教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年3月Preliminarystudiesonproductionandphenotypeofmyostatingeneinactivationsheepbysomaticcellnucleart

2、ransferADissertationSubmittedtoShiheziUniversityfortheDegreeofDoctorofAgricultureByHuShengwei(AnimalGeneticsBreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuMarch,2012课题来源国家转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08005-003B）石河子大学研究生创新基金重点项目（YJCX2010-Z02）石河子大学学

3、位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编

4、入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN），属于转化生长因子β（TGF-β）超家族成员，是骨骼肌生长和发育的负调控因子。研究发现myostatin基因敲除小鼠的骨骼肌重量增加了2-3倍，肌肉组织发生广泛的增生和肥大。Myostatin自然突变的牛也表现出肌肉异常发达的“双肌”表型。Myostatin基因突变小鼠和牛的肌肉重量显著增加，为通过抑制绵羊myosta

5、tin基因表达提高绵羊产肉率提供了很好的动物模型。因此，本研究以绵羊myostatin基因为靶基因，分别利用RNA干扰和基因打靶技术制备myostatin失活的转基因克隆绵羊，探索一条提高绵羊产肉率的技术路线，为培育高产肉性能的肉用绵羊新品种奠定基础。同时，本研究对死亡克隆羔羊的各种组织进行了组织学和形态学观察，初步分析了微小RNA（microRNA）在克隆绵羊胎盘中的表达和功能。本文的主要研究内容如下:1.利用PCR克隆绵羊U6启动子，以EGFP荧光报告系统验证绵羊U6启动子的活性；利用软件设计4个针对绵

6、羊myostatin基因的shRNA（shMSTN），以荧光定量RT-PCR方法筛选有效抑制myostatin基因表达的shMSTN；以电转化法将shMSTN表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞，筛选myostatin基因稳定沉默的绵羊胎儿成纤维细胞；再利用体细胞核移植技术制备myostatin基因沉默的转基因克隆绵羊；利用PCR和westernblot对转基因绵羊进行鉴定；通过称重检测转基因绵羊的日增重情况，利用组织学方法对转基因绵羊肌肉组织进行分析。以上实验结果显示，从绵羊基因组中PCR扩增获得两个绵羊U6启

7、动子（sU6-1和sU6-2），sU6-1和sU6-2含有U6启动子典型的TATA-box、PSE、SPH和OCT结构元件，具有启动shRNA表达的活性，可用于绵羊RNAi的研究；筛选获得一个高效抑制myostatin基因表达的shMSTN3，干扰效率达到87%；经G418筛选获得46个抗性细胞克隆，经PCR鉴定其中12个为阳性克隆，将阳性细胞进行体细胞核移植获得克隆胚胎，胚胎的卵裂率为68%，囊胚率为15%。将克隆胚胎移植到74只受体羊中，35天后有26只绵羊妊娠，其中5只受体羊怀孕足月，出生5只克隆羔羊

8、，其中1只出生后即死亡，1只在出生22天后死亡，另外3只目前健康存活。出生的羔羊基因组中整合有外源shRNA基因，肌肉组织中myostatin表达水平明显下降。转基因克隆绵羊日增重高于对照组，并且肌肉细胞明显肥大。以上研究结果表明，将RNA干扰和体细胞核移植技术相结合可制备myostatin基因沉默的转基因克隆绵羊，为培育高产肉率肉用绵羊新品种奠定基础。2.利用长片段PCR技术和常规分子克隆技术制备绵羊myost