绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin)基因敲除初步的研究

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1、～、●一‘I．1吖、●●§．-}节，～：}7I妊。、，’J学位论文独创性声明IIIIIIIIIIlllllllll／lllllllll／llllllllIIIIllllllY1890793本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：&里学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被

2、查阅和借阅。本文授权’辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。．保密的学位论文在解密后使用本授权书。l，．，，飞学位论文作者签名：一■Ij蕊I舾b研指导教师签名：么薤查签名日期：知，'年占月g日^●，‘1．≮I◆^一一)3^一l嘶辽宁师范大学硕士学位论文摘要肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又名GDF．8(转化生长因子)，首次于1997年美国约翰霍普金斯大学医学院Mcpherron科研小组在研究TGF．D(转化生长因子超家族)时采用简并PCR法在

3、该家族的保守区域扩增得以发现。该基因作为骨骼肌特异性生长发育的负调控因子，遗传突变功能失活后能够产生肌肉急剧增加的“双肌表型"。本研究利用基因敲除技术体外构建针对绵羊Myostatin基因第--#b显子缺失的基因敲除载体，转染入绵羊成纤维细胞，利用骨架载体上Neo基因替代Myostatin基因的exon3，以期达到使细胞内Myostatin基因失活的目的。对绵羊体细胞Myostatin基因敲除的可行性进行初步探索研究；为创制肉羊育种新材料、培育转基因绵羊奠定基础。本论文主要的研究结果如下：(1)根据绵羊Myostatin基因全序列(GenBankNo．DQ530260)利用LA．PCR

4、技术，成功扩增得到绵羊Myostatin基因同源长臂4．9k，包括全部的exonl，intronl，exon2，及部分启动子和大部分intron2；同源短臂1．1K，包括部分exon3和3’非翻译区序列，将二者连入PloxpII正负筛选基因敲除骨架载体，成功构建专门针对Myostatin第三外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpII．OVIS．MSTN(13．5K)，酶切和测序鉴定证明载体构建正确。(2)通过组织块贴壁的方法建立绵羊耳缘组织成纤维细胞系，增殖活力良好，为后续细胞转染实验奠定基础。(3)建立了绵羊Myostatin基因敲除载体转染及筛选方法：脂质体2．5ul，敲除载体2

5、ug，转染效率较高；经过300ug／mlG418初步筛选7．10天，而后经200ug／mlG418加50nmol／1GANC维持筛选20天左右可得到明显的细胞克隆。(4)经过30天左右的正负筛选共得到64个细胞克隆，经PCR鉴定后初步认为12号细胞克隆为发生了同源重组的阳性细胞克隆。本研究根据Myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生“双肌”表型的特点，利用基因敲除技术使绵羊细胞内Myostatin基因缺失，从而为应用基因敲除及体细胞克隆技术相结合制作产肉率高的转基因肉羊建立技术研究平台，为肉羊育种及品种改良提供新思路。关键词：绵羊；Nyostatifl

6、基因敲除；置换型敲除载体

7、；成纤维细胞’：Ijt^0I’^●。●、■，-，I■'一、0^hI-绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除的初步研究PreliminaryResearchonKnockoutofMyostatingeneinCulturedSheepFibroblastsAbstractMyostatin(MSTN)alsoknownasGDF-8(growthanddifferentiationfactor-8)whichWasfirsttobeidentifiedinusingdegeneratePCRtechniquewhenamplifiedtheconservedregi

8、onsofTGF—p(transforminggrowthfactor-13)familybyMepherron(JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicineresearchgroup)in1997．Researchshowedthatfuctionalinactivationofgeneticmutationsofmyostatincouldleadtomusclequantitysurgetoproduce‘